Oct 01, 2020

Public workspacetotal RNA抽提

This protocol is a draft, published without a DOI.
  • 1西南大学
  • Zhang Xue
张 雪
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Protocol Citation: 张 雪 2020. total RNA抽提. protocols.io https://protocols.io/view/total-rna-bmxgk7jw
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License,  which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: October 01, 2020
Last Modified: October 01, 2020
Protocol Integer ID: 42696
Abstract
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
Before start
注意全程保持低温，且使用RNase-free枪头，收集胚胎前提前打开离心机，保持在4°C，12000 rcf
打开离心机，保持在4°C，12000 rcfCentrifigation12000 rcf, 4°C, 00:30:00

取材：收集10~40个所需时期的斑马鱼胚胎
用1×PBS漂洗，5min×2TemperatureOn ice
Note
全程冰上操作，RNase-free枪头


每管加入1ml TRIZOL试剂，放置冰上反复吹打，4°C，12000 rcf，离心10minTemperatureOn ice Duration00:10:00

Note
用力吹打的同时注意不要让液体溅出

上清转移至新的EP管，冰上放置5minTemperatureOn ice Duration00:05:00

加入200µl 氯仿后，剧烈震荡15s，冰上静置3minTemperatureOn ice Duration00:03:00

4°C，12000rcf，离心15minDuration00:15:00

将上层无色水相转移至新EP管中，加入等体积（约500µl）的异丙醇（RNA专用），混匀，-20°C静置20minTemperature-20 °C Duration00:20:00

4°C，12000g rcf，离心10min，去上清，留沉淀Duration00:10:00

用1ml 75％乙醇（RNA专用无水乙醇加RNase-free H2O, 70%-80%均可）漂洗沉淀，4°C，7500g离心5minCentrifigation7500 rcf, 4°C, 00:05:00

重复上一步骤，然后去上清，留沉淀Centrifigation7500 rcf, 4°C, 00:05:00

室温倒置于纸上晾干，加20µl RNase-free H2O溶解TemperatureRoom temperature

1µl测浓度，其余-80°C贮存Temperature-80 °C