Jul 23, 2025
Version 1
Surveillance Génomique du Paludisme par la méthode Nanopore : Protocole Rapide NOMADS-MVP V.1
This protocol is a draft, published without a DOI.
- Karolina Mosler1,
- Mulenga Mwenda2,
- Daniel Bridges3,
- Jason Alexander Hendry1
- 1Max Planck Institute for Infection Biology;
- 2PATH Zambia;
- 3DB Scientific
Protocol Citation: Karolina Mosler, Mulenga Mwenda, Daniel Bridges, Jason Alexander Hendry 2025. Surveillance Génomique du Paludisme par la méthode Nanopore : Protocole Rapide NOMADS-MVP. protocols.io https://dx.doi.org/
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: March 31, 2025
Last Modified: July 23, 2025
Protocol Integer ID: 125807
Keywords: surveillance génomique du paludisme par la méthode nanopore, paludisme par la méthode nanopore, pfhrp2, les antigène, pfhrp3, surveillance génomique, des amplicons ciblant les principaux gène, résistance aux médicaments antipaludique, diagnostic rapide, pfama1, protocole rapide nomad
Funders Acknowledgements:
Bill and Melinda Gates Foundation
Grant ID: INV-048316
Disclaimer
Ce protocole est une version préliminaire et l'équipe NOMADS apprécie toute correction ou commentaire de la part des utilisateurs.
Abstract
L'approche NOMADS Minimum Viable Panel (MVP) permet une surveillance génomique rapide du paludisme à P. falciparum grâce au séquençage par la méthode Nanopore. Cette méthode utilise des amplicons ciblant les principaux gènes de résistance aux médicaments antipaludiques (pfcrt, pfdhfr, pfdhps, pfkelch13, pfmdr1), les antigènes des tests de diagnostic rapide (TDR) (pfhrp2, pfhrp3), un gène à haute diversité (pfama1) et la cible du vaccin RTS'S (pfcsp). Il faut moins d'une journée pour passer de l'extraction d'ADN à la génération de données et les résultats peuvent être visualisés en temps réel à l'aide du tableau de bord Nomadic (https://jasonahendry.github.io/nomadic/).
Le protocole utilise une seule PCR multiplexe à partir d'extrait d'ADN sans préamplification, combinée au codage rapide de l'ADN par le kit de barres-codes (SQK-RBK114.96) d'Oxford Nanopore Technologies (ONT) pour accélérer et simplifier la préparation de la librairie. La longueur médiane de lecture (sequence nucléotidique) est généralement comprise entre 400 et 600 pb, et plus de 80 échantillons peuvent être multiplexés en une seule analyse. Sur un ensemble d'échantillons de sang séché sur papier buvard (DBS) sur le terrain, le taux de réussite est modéré (>60 %) pour les échantillons avec une parasitémie >100 p/uL, et bon (>90 %) pour les échantillons avec une parasitémie >1000 p/uL. Le protocole a été validé pour la détection de polymorphisme mononucleotidique (SNP) dans des échantillons clonaux et la détection de la délétion hrp2/3.
We would like to say thank you to Dr. Arsène Zongo for preparing the French translation of the NOMADS-MVP protocol. Nous tenons à remercier le Dr Arsène Zongo pour avoir préparé la traduction française du protocole NOMADS-MVP.
Materials
MVP Primers
| Name | Sequence | Quantity to order (nmole) | Formulation | |
| ama1-d2-18-ck_v43_F | CAACACGCATATCCAATAGACCA | 25nm | STD | |
| ama1-d2-18-ck_v43_R | TGATCCGAAGCACTCAATTCAA | 25nm | STD | |
| crt-k76_v27_F | AGCAAAAATGACGAGCGTTATAGA | 25nm | STD | |
| crt-k76_v27_R | AGCTTCGGTGTCGTTCCTAAA | 25nm | STD | |
| csp-rtss-repeat_v4_F | TCGCAAACGTAATTAAATATTCACAAA | 25nm | STD | |
| csp-rtss-repeat_v4_R | CCTTATTCCAGGAATACCAGTGC | 25nm | STD | |
| dhfr-p51-p164_v19_F | CCATTTTTGTATTCCCAAATAGCTAGT | 25nm | STD | |
| dhfr-p51-p164_v19_R | TCCCTAGTACCATTAGCTTCCCA | 25nm | STD | |
| dhps-p436-p613_v55_F | TCCATTCCTCATGTGTATACAACA | 25nm | STD | |
| dhps-p436-p613_v55_R | TGTTTAATCACATGTTTGCACTTTCC | 25nm | STD | |
| hrp2-exon2-complete_v26_F | TCGCTATCCCATAAATTACAAAACA | 25nm | STD | |
| hrp2-exon2-complete_v26_R | CCGTTTTTGCCTCCGTACTT | 25nm | STD | |
| hrp3-exon2-complete_v21_F | AGACAGTAGAAAAATCGCTATCCT | 25nm | STD | |
| hrp3-exon2-complete_v21_R | GCCGTTTTTGCTTCCGTACTT | 25nm | STD | |
| kelch13-cterm_v5_F | AAGGGAAAATCATAAACAATCAAGT | 25nm | STD | |
| kelch13-cterm_v5_R | GGAAGACATCATGTAACCAGAGA | 25nm | STD | |
| mdr1-p1034-p1246_v19_F | GCGGAGTTTTTGCATTTAGTTCAG | 25nm | STD | |
| mdr1-p1034-p1246_v19_R | CCAATGTTGCATCTTCTCTTCCA | 25nm | STD | |
| mdr1-p86-p184_v26_F | CGTTTAAATGTTTACCTGCACAACA | 25nm | STD | |
| mdr1-p86-p184_v26_R | ACTTGCAACAGTTCTTATTCCCA | 25nm | STD |
MVP Multiplex PCR Reagents
| Product | Order number | Vendor | |
| KAPA HiFi HS RM (6.25ml) | 07958935001 (KK2602) | Roche | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | Q33231 | Thermo Fisher Scientific | |
| AMPure XP Beads | A63881 | Beckman Coulter |
Rapid Sequencing
| Product | Order number | Vendor | |
| Rapid sequencing DNA V14 | SQK-RBK114.96 | Oxford Nanopore | |
| Flow Cell R.10 | FLO-MIN114 | Oxford Nanopore | |
| Flow Cell Wash Kit | EXP-WSH004 | Oxford Nanopore |
| Abbr. | Definition | |
| MVP | Minimum Viable Panel | |
| DNA | Deoxyribonucleic acid | |
| PCR | Polymerase chain reaction | |
| DBS | Dried blood spot | |
| EB | Elution buffer | |
| bp | Base pair | |
| QC | Quality control | |
| AMPure XP beads | Magnetic beads used for purification | |
| RFU | Relative fluorescence units | |
| ng | Nanogram | |
| ul | microliter | |
| min | Minutes | |
| sec | Seconds |
Plasticware
| Plastics | Comment | |
| 1.5 ml Low Bind Tubes | Eppendorf | |
| 100 ml Reservoir | Needed in purification step | |
| 15ml or 50ml Falcon Tube | For ethanol preparation | |
| 96-well Plates | Ensure they fit your thermalcycler | |
| 96-well Plate Seals | ||
| Strip Tubes | For aliquoting master mix | |
| Qubit Tubes |
Information importante
Inclure des contrôles
Toujours inclure au moins un contrôle positif (souche de laboratoire connue) et un contrôle négatif (eau sans nucléase ou eau PCR grade) dans chaque cycle de séquençage.
Eviter les contaminations
Le séquençage de l'ADN est très sensible à la contamination.
Veuillez suivre les étapes suivantes pour éviter toute contamination pendant votre travail :
- Avant de commencer, nettoyez les surfaces avec de l'eau de Javel à 10 %, puis lavez-les avec de l'éthanol à 70 % (vous pouvez également utiliser de l'éthanol à 70 %, puis une solution comme DNA exitus).
- Aliquoter les réactifs de grand volume en plus petits volumes afin qu'ils ne soient pas utilisés pour plusieurs expériences. Par exemple, nous recommandons fortement d'aliquoter le KAPA HiFi ReadyMix (des aliquotes de 845 µl sont suffisantes pour des lots de 48 échantillons).
- Si possible, effectuez tous les travaux de pré-PCR dans un espace propre séparé.
- Changez toujours les embouts entre les échantillons.
- Centrifugez toujours les tubes ou les plaques avant de les ouvrir.
- Ne touchez jamais les réactifs ou les pipettes sans gants.
Sélectionner les échantillons appropriés pour le séquençage
Parasitémie : Nous avons traité plus de 500 taches de sang séché sur le terrain (DBS) avec ce protocole provenant de plusieurs pays et études à travers l'Afrique subsaharienne. En général, nous observons de très bons taux de réussite (>90 %) pour les échantillons avec une parasitémie >1000 p/uL ; et des taux de réussite modérés (>60 %) pour les échantillons avec une parasitémie >100 p/uL.
Extraction de l'ADN : Nous avons observé de meilleures performances pour les échantillons extraits avec les kits Qiagen, plutôt qu'avec Chelex.
Qualité : Il est important d'utiliser du papier filtre Whatman 3 ou équivalent pour les taches de sang séché (DBS). Extraire l'ADN rapidement après le prélèvement des DBS et le conserver à -20 °C est le meilleur moyen de maintenir la qualité de l'ADN. Les échantillons qui restent longtemps sous forme de DBS (> 6-12 mois) peuvent être moins performants.
Si vous travaillez dans une plaque à 96 puits :
Chaque ajout de réactif (par exemple, le master mix ou l'eau dans l'étape d'élution) peut d'abord être ajouté dans un tube à barrette de 8 puits, afin que vous puissiez utiliser une pipette multicanale pour ajouter les réactifs par colonne. Vérifiez toujours l'absorption et la libération du réactif dans chaque embout lorsque vous utilisez une pipette multicanale.
PCR Multiplexe MVP
PCR MVP
Preparer les amorces individuelles :
Les amorces sont livrées lyophilisées et doivent être reconstituées à 100 uM dans de l'eau sans nucléase ou un faible tampon TE comme suit :
- Centrifuger toutes les amorces lyophilisées avant de les ouvrir.
- Sur chaque tube, vous trouverez des informations sur la molarité, par exemple 24,8 nmol. Vous devrez ajouter 248 ul d'eau sans nucléase ou de faible tampon TE pour obtenir une concentration de 100 uM.
Attention: Attention : le volume nécessaire pour chaque amorce sera différent !
Exemple:
Pour l'amorce csp-rtss-repeat_v4_F,
26.7 nmol est marqué sur le tube.
Ajouter 267 ul d'eau sans nuclease (PCR grade)
- Préparer toutes les amorces à une concentration de 100 uM, bien les agiter au vortex et les centrifuger.
Preparer le pool d'amorces:
- Pour préparer le pool d'amorces, combinez 7,5 ul des amorces dhps et 5 ul de chaque autre amorce (100 uM) dans un nouveau tube. Votre volume total sera de 105 ul.
| Name | Sequence | Volume into Pool (ul) | |
| ama1-d2-18-ck_v43_F | CAACACGCATATCCAATAGACCA | 5 | |
| ama1-d2-18-ck_v43_R | TGATCCGAAGCACTCAATTCAA | 5 | |
| crt-k76_v27_F | AGCAAAAATGACGAGCGTTATAGA | 5 | |
| crt-k76_v27_R | AGCTTCGGTGTCGTTCCTAAA | 5 | |
| csp-rtss-repeat_v4_F | TCGCAAACGTAATTAAATATTCACAAA | 10 | |
| csp-rtss-repeat_v4_R | CCTTATTCCAGGAATACCAGTGC | 10 | |
| dhfr-p51-p164_v19_F | CCATTTTTGTATTCCCAAATAGCTAGT | 10 | |
| dhfr-p51-p164_v19_R | TCCCTAGTACCATTAGCTTCCCA | 10 | |
| hrp2-exon2-complete_v26_F | TCGCTATCCCATAAATTACAAAACA | 5 | |
| hrp2-exon2-complete_v26_R | CCGTTTTTGCCTCCGTACTT | 5 | |
| hrp3-exon2-complete_v21_F | AGACAGTAGAAAAATCGCTATCCT | 5 | |
| hrp3-exon2-complete_v21_R | GCCGTTTTTGCTTCCGTACTT | 5 | |
| kelch13-cterm_v5_F | AAGGGAAAATCATAAACAATCAAGT | 7.5 | |
| kelch13-cterm_v5_R | GGAAGACATCATGTAACCAGAGA | 7.5 | |
| mdr1-p1034-p1246_v19_F | GCGGAGTTTTTGCATTTAGTTCAG | 5 | |
| mdr1-p1034-p1246_v19_R | CCAATGTTGCATCTTCTCTTCCA | 5 | |
| mdr1-p86-p184_v26_F | CGTTTAAATGTTTACCTGCACAACA | 5 | |
| mdr1-p86-p184_v26_R | ACTTGCAACAGTTCTTATTCCCA | 5 | |
| dhps-p436-p613_v55_F | TCCATTCCTCATGTGTATACAACA | 10 | |
| dhps-p436-p613_v55_R | TGTTTAATCACATGTTTGCACTTTCC | 10 | |
- Prendre 100 µl du pool d'amorces et ajouter 900 µl d'eau sans nucléase ou de faible tampon TE pour obtenir une dilution (solution) de travail de 10 µM et bien mélanger.
- Préparer 4 aliquotes du pool d'amorces de 250 µl chacune.
- Conserver 3 aliquotes à -20°C et conserver l'aliquote de travail à 4°C.
Preparer le programme d'amplification PCR
| Step | Temp (°C) | Time | No. of Cycles | |
| Prepare Block | 95 | Forever | 1 | |
| Initial Denaturation | 95 | 3 min | 1 | |
| Denaturation | 98 | 20 sec | 35 | |
| Extension | 60 | 3 min | ||
| Final Extension | 60 | 10 min | 1 | |
| Hold | 8 | Forever | 1 |
La durée totale est d'environ 2 heures et 28 minutes.
Preparer les échantillons
- Transférer 8 µl d'extrait d'ADN de chaque échantillon dans un puits unique d'une plaque à 96 puits.
- Couvrir la plaque pendant la préparation du mélange réactionnel (master mix).
Preparer le mélange réactionnel (master mix)
- Avant de préparer le master mix, lancer le programme PCR pour préchauffer le bloc à 95 °C.
- Preparer le master mix comme suit sur portoir refrigéré ou de la glace:
| Reagent | Vol. per sample (ul) | Vol. per 48 sample (ul) [+10% excess] | |
| KAPA ReadyMix 2X | 15.5 | 818 | |
| MVP primer pool (10uM) | 1.5 | 79 | |
| Total | 17 | 897 |
- Mélanger le master mix en pipettant.
- Transférez 17 ul de master mix dans chaque échantillon. Lorsque vous préparez de nombreux échantillons, divisez votre master mix en aliquotes dans un tube à barrette de 8 puits, puis transférez le master mix dans les échantillons à l'aide d'une pipette multicanale pour améliorer l'homogénéité.
- Mélanger bien en pipettant, sceller la plaque et centrifuger.
- Placez la plaque dans le thermocycleur préchauffé et appuyez sur « Resume » ou « Skip Step » pour lancer la PCR.
Contrôle qualité par electrophorèse
- Après la PCR, migrer 1 à 2 ul de chaque produit de PCR sur un gel d'agarose à 0,66 % avec un marqueur de poids moléculaire de 1 kb.
- Vos résultats devraient ressembler à la figure ci-dessous:
Exemple de gel d'agarose de NOMADS-MVP. Les témoins positifs sont présentés à trois niveaux de parasitémie. Le témoin négatif est de l'eau sans nucléase. Sept échantillons de terrain sont présentés ; l'un d'entre eux a échoué.
Purification Post-PCR des amplicons
Assurez-vous que vos billes AMPure XP sont à température ambiante ! Mélangez les billes AMPure XP au vortex pendant au moins 30 secondes pour vous assurer qu'elles sont en suspension avant de les pipeter ! Préparez une nouvelle solution d'éthanol à 80 % à chaque fois.
| # of samples | Vol. Ethanol | Vol. Water | Total vol. | |
| 24 | 12 ml | 3 ml | 15 ml | |
| 48 | 20 ml | 5 ml | 25 ml | |
| 96 | 36 ml | 9 ml | 45 ml |
Instructions pour la préparation de l'éthanol à 80 %. Un peu d'excédent est inclus pour l'utilisation avec le réservoir.
Purification Post-PCR des amplicons
- Aliquoter les billes AMPure XP mélangées dans un tube à barette de 8 puits puis distribuer à l'aide d'une pipette mullticanale pour améliorer l'homogénéité.
- Ajouter 12 ul de billes AMPure XP aux amplicons (le ratio est de 0.5X)
- Mélangez bien à l'aide d'une pipette. Vérifiez visuellement que les billes sont bien mélangées dans toute la solution (voir l'image ci-dessous).
- Incuber pendant 5 minutes à température ambiante (pas sur le portoir magnétique).
- Incuber pendant 5 à 8 minutes sur le portoir magnétique
- Retirez le surnageant en laissant environ 5 uL. Veillez à ne pas transférer de billes.
- Tout en maintenant la plaque sur le portoir magnétique, laver les billes en ajoutant 175 µl d'éthanol à 80 %. (Pour une plaque à 96 puits, ajouter l'éthanol dans un réservoir puis distribuer avec une pipette multicanale).
- Attendre pendant 30 secondes.
- Retirer et jeter le surnageant.
- Répéter le lavage à l'éthanol en ajoutant 175 µl supplémentaires d'éthanol à 80 %, en laissant agir pendant 30 secondes et en éliminant le surnageant.
- Centrifuger brièvement les échantillons, puis remettez-les sur le portoire magnétique et éliminez tout résidu d'éthanol. Assurez-vous que tout l'éthanol a été éliminé.
- Séchez les billes à l'air jusqu'à ce qu'elles semblent sèches, par exemple 30 secondes à 1 minute.
- Remettre les billes en suspension dans 15 µl d'eau sans nucléase en pipettant.
- Incuber 3 minutes à température ambiante pour que l'ADN soit libéré des billes.
- Remettre les échantillons sur le portoir magnétique pendant 2 minutes ou jusqu'à ce que les billes se soient agglomérées et que la solution soit claire.
- Transférer 14 µl de surnageant dans une nouvelle plaque à 96 puits.
- Quantifier l'ADN purifié à l'aide du Qubit DNA assay kit en utilisant 1 ul d'ADN purifié. Une bonne concentration est >30 ng/ul ou plus.
- Point d'arrêt: il est possible d'arrêter l'expreience à cette étape. Conserver l'ADN purifié à -20 °C ou +4 °C.
- Exemple de purification d'ADN aux billes. Dans le puits de gauche, les billes sont correctement mélangées. Dans le puits du milieu, il y a des gouttelettes ; la plaque doit être centrifugée. Dans le puits de droite, il faut davantage pipeter et mélanger.
Quantification de l'ADN avec Qubit
Sortir tous les réactifs Qubit (une aliquote du colorant et les standards) et laisser incuber à température ambiante pendant 20 à 30 minutes.
Toujours conserver le réactif Qubit (colorant) à l'abri de la lumière.
- Préparer un tube Qubit par échantillon et deux tubes Qubit pour les standards et étiqueter les couvercles des tubes. Utilisez toujours des tubes de dosage Qubit (Q32856) pour la quantification.
- Pour chacun des deux standards, répartir 190 µl de réactif Qubit dans des tubes étiquetés
- Pour les tubes d'échantillons, aliquotez 199 µl de réactif Qubit par échantillon.
- Le volume final dans chaque tube doit être de 200 ul (après ajout des échantillons ou des standards)
- Ajoutez 10 µl de chaque standard dans les tubes préparés. Veillez à ajouter 10 µl, sinon vos lectures seront incorrectes !
- Ajoutez 1 ul de votre échantillon dans chaque tube.
- Mélanger au vortex brièvement tous les tubes et incuber pendant 2 minutes à température ambiante (à l'abri de la lumière).
- Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans le melange
- Après incubation, mesurer la concentration des deux standards (en suivant les instructions de l'appareil)
- Les valeurs approximatives des standards pourraient être de l'ordre de :
Standard I : ~ 100 RFU
Standard II: ~ 45000 RFU
- Mesurer et noter la concentration des échantillons.
- La concentration optimale en utilisant Qubit DNA assay avec 1 ul d'ADN purifié est >30 ng/ul ou plus.
Codage rapide des échantillons
Il s'agit d'une version simplifiée du protocole original de séquençage . Il est fortement recommandé de se référer au protocole original sur le site web pour des instructions plus détaillées, en particulier sur la vérification et le chargement des flow cells.
Remarque : soyez très prudent lorsque vous retirez la couverture (film adhesif) de la plaque de code-barres rapides ! Vous devez éviter la contamination croisée des codes-barres.
- Transférer environ 50 à 600 ng par échantillon dans une nouvelle plaque, dans un volume total ne dépassant pas 10 ul.
- Si possible, utilisez des volumes égaux pour tous les échantillons afin d'éviter toute contamination. Completer jusqu'à 10 ul avec de l'eau sans nucléase.
- Centrifuger brièvement la plaque de codes-barres rapides et placez-la sur de la glace. Retirez délicatement la couverture.
- Ajoutez 1 ul du code-barres rapides à chaque échantillon. Utilisez une pipette multicanale et ajoutez les codes-barres par colonne, de sorte que chaque échantillon ait un code-barres différent. Vérifiez chaque embout de pipette pour vous assurer que les codes-barres sont bien ajoutés ! Très important !
- Mélanger soigneusement à l'aide d'une pipette et centrifuger brièvement.
- Incuber la plaque dans le thermocycleur suivant le programme ci-dessous :
| Step | Temp. (°C) | Time | |
| Prepare block | 30 | Forever | |
| Tagmentation | 30 | 2 min | |
| Inactivation | 80 | 2 min | |
| Hold | 8 | Forever |
Pooler tous les échantillons déja munis de codes-barres et purifier le pool
- Centrifuger brièvement la plaque pour recueillir le liquide au fond.
- Pipetter 5 µl de chaque échantillon à code-barres dans un tube Low Bind de 1,5 ml
- Avec une pipette multicanale, prélevez d'abord 5 µl de chaque échantillon (de chaque colonne de la plaque) dans un tube à barettes PCR.
- Transférer enfin du tube à barettes PCR dans un tube propre de 1,5 ml. Il est fortement recommandé de mesurer à nouveau le volume total de votre pool à l'aide d'une pipette monocanale afin d'ajouter le volume correct de billes AMPure XP lors de l'étape suivante.
- Conservez les échantillons restants munis de codes-barres à 4 °C en guise de sauvegarde.
Purification post-pooling
Assurez-vous que vos billes AMPure XP sont à température ambiante ! Mélangez les billes AMPure XP au vortex pendant au moins 30 secondes pour vous assurer qu'elles sont en suspension avant de les pipeter ! Préparez une nouvelle solution d'éthanol à 80 % à chaque fois.
| # of samples | Vol. Ethanol | Vol. Water | Total vol. | |
| 24 | 0.8 ml | 0.2 ml | 1 ml | |
| 48 | 0.8 ml | 0.2 ml | 1 ml | |
| 96 | 2.4 ml | 0.6 ml | 3 ml |
Directives pour la préparation de l'éthanol à 80 %.
- Effectuer la purification avec un ratio de 0.5X de billes AMPure XP.
- Pour un pool de 150 µl, ajoutez 75 µl de billes AMPure XP agitées au vortex. (vérifiez le volume de votre pool avec une pipette monocanal, pour ajouter le bon volume de billes AMPure XP).
- Incuber 5 minutes à température ambiante.
- Préparer de l'éthanol à 80 % frais selon le tableau ci-dessus.
- Placer le pool sur un portoir magnétique pendant 5 à 8 minutes jusqu'à ce que la solution soit claire. Retirer le surnageant.
- Garder le tube sur le portoir magnétique et laver les billes en ajoutant de l'ethanol 80 % fraîchement préparée jusqu'à ce que les billes soient complètement recouvertes d'éthanol, sans déplacer le culot. En général, 500 ul d'éthanol suffisent.
- Rétirer le surnageant
- Répeter l'étape précédente
- Centrifuger brièvement le tube et le replacer sur le portoir magnétique. Pipeter tout résidu d'éthanol. Laisser sécher à l'air ambiant pendant 1 minute.
- Retirer le tube du portoir magnétique et remettre le culot en suspension dans 15 µl de tampon d'élution ou d'eau sans nuclease. Si vous avez plus de 48 échantillons en pool, vous pouvez augmenter le volume d'élution, par exemple à 30 ul.
- Incuber pendant 8 minute à température ambiante.
- Incuber sur le portoir magnétique pendant 1 minute jusqu'á ce que l'eluat soit clair.
- Retirer et conserver 14 ul d'éluat dans un nouveau tube. Pour un nombre d'échantillons plus élevé >48, l'élution peut être effectuée dans 30 ul.
- Utilisez 1 ul d'eluat pour réaliser une dilution 1:10 dans l'eau sans nucléase. Quantifiez 2 ul de la dilution 1:10 avec Qubit. La concentration de votre pool non dilué doit être >50 ng/ul.
- Transférer environ 800 ng du pool dans un nouveau tube avec un volume total de 11 ul . Si nécessaire, completer jusqu'à 11 ul avec un tampon d'elution (EB).
Ligature rapide des adaptateurs
Utilisez toujours une dilution fraîchement préparée de l'adaptateur rapide (RA). N'utilisez pas l'adaptateur dilué pendant plusieurs jours.
- Mélanger l'adaptateur rapide (RA) par pipetage et le tampon d'adaptateur (ADB) au vortex.
- Dans un nouveau tube Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml, diluer l'adaptateur rapide (RA) comme suit et mélanger en pipettant.
| Reagent | |
| 1.5 ul Rapid Adapter (RA) | |
| 3.5 ul Adapter Buffer (ADB) |
- Ajouter 1 ul de l'adaptateur rapide dilué à l'ADN portant un code-barres.
- Mélangez doucement en tapotant le tube, puis centrifuger brièvement. Attention! ne pas agiter aux vortex
- Incuber la réaction pendant 5 minutes à température ambiante.
Amorçage et chargement de la flow cell
- Préparer le mélange d'amorçage en combinant les réactifs suivants dans un nouveau tube.
| Volume | Reagent | |
| 1170 ul | Flow Cell Flush (FCF) | |
| 30 ul | Flow Cell Tether (FCT) |
- Mélanger en retournant le tube et pipeter le mélange à température ambiante.
- Ouvrez le port d'amorçage (Priming port), réglez une pipette de 1000 ul sur 200 ul, faites défiler vers le haut jusqu'à ce que vous puissiez voir un petit volume de tampon entrer dans l'embout de la pipette. (Pour éliminer l'air)
- Pipeter et charger lentement 800 µl du mélange d'amorçage (FCF+FCT) dans la flow cell par le port d'amorçage . Évitez l'introduction de bulles d'air !
- Attendre 5 minutes.
- Pendant ce temps, préparez comme indiqué dans le tableau ci-dessous la librairie pour le chargement :
| Volume | Reagent | |
| 37.5 ul | Sequencing Buffer (SB) | |
| 25.5 ul | Library Beads (LIB) mixed immediately before use | |
| 12 ul | DNA Library (adapter ligated pool) |
- Soulevez doucement le capuchon du port d'échantillonnage (SpotON sample port) pour accéder à ce dernier.
- Chargez lentement 200 µl du mélange d'amorçage dans le port d'amorçage de la flow cell (et non dans le port d'échantillonnage), en évitant l'introduction de bulles d'air.
- Ajoutez 75 μl de la librairie préparée à la Flow Cell par le port d'échantillonnage, goutte à goutte. Assurez-vous que chaque goutte s'écoule dans le port avant d'ajouter la suivante.
- Remettez doucement en place le capuchon du port d'échantillonnage et fermez le port d'amorçage .
- Demarrer le sequencage