Dec 08, 2025
Version 2
Stx2 Subtypisierung V.2
- Emanuel Heitlinger1,
- Bettina Welter1,
- Nadja Walter1,
- olivia.hollaender 1,
- Philipp Zanger1
- 1Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz
Protocol Citation: Emanuel Heitlinger, Bettina Welter, Nadja Walter, olivia.hollaender , Philipp Zanger 2025. Stx2 Subtypisierung. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bp2l6z5k5gqe/v2Version created by Emanuel Heitlinger
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: December 08, 2025
Last Modified: December 08, 2025
Protocol Integer ID: 234436
Keywords: EHEC, HUS, Shigatoxin, stx, stx2, stx2-subtyping, risk variants of stx2, relevant distinction from other stx2 variant, other stx2 variant, enterohemorrhagic escherichia coli, urämischen syndrom, 2c und 2d
Abstract
Nach §34 IfSG müssen in Deutschland Personen, die Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) ausscheiden, bis zum Ausschluss einer relevanten Infektionsgefahr von Gemeinschaftseinrichtungen ferngehalten werden. Die Wiederzulassung orientiert sich an Empfehlungen des Robert Koch-Instituts (EHEC: Überarbeitung der RKI-Empfehlungen für die Wiederzulassung zu Gemeinschaftseinrichtungen gemäß §34 IfSG nach EHEC-Infektion, Epid Bull 47/2019). Als Hochrisikovarianten für das Auftreten eines hämolytisch-urämischen Syndroms (HUS) gelten insbesondere die stx2-Subtypen 2a, 2c und 2d.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt einen real-time qPCR-Assay, der gezielt diese drei Hochrisikovarianten von stx2 detektiert und damit eine diagnostisch relevante Abgrenzung zu anderen, mit geringerem HUS-Risiko assoziierten stx2-Varianten ermöglicht. Die Primer und Hydrolysesonden basieren auf Harada et al. (2023), wurden jedoch in einem kombinierten One-Tube-Format zusammengeführt. Dadurch wird das Assay für Anwendungen in der Wiederzulassungspraxis erheblich vereinfacht. Der Ansatz kann jedoch in Einzelfällen zu eingeschränkter Differenzierbarkeit der Subvarianten führen.
Stx2 Subtyping
According to Section 34 of the German law for the prevention of infections (IfSG), persons in Germany who excrete enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) must be kept away from communal facilities until the relevant risk of infection has been ruled out. Readmission is based on recommendations from the Robert Koch Institute (EHEC: Revision of the RKI recommendations for readmission to community facilities in accordance with Section 34 IfSG after EHEC infection, Epid Bull 47/2019). The stx2 subtypes 2a, 2c, and 2d are considered high-risk variants for the occurrence of hemolytic uremic syndrome (HUS).
The protocol presented here describes a real-time qPCR assay that specifically detects these three high-risk variants of stx2, thus enabling a diagnostically relevant distinction from other stx2 variants associated with a lower risk of HUS. The primers and hydrolysis probes are based on Harada et al. (2023), but have been combined in a one-tube format. This greatly simplifies the assay for use in readmission practices. However, in individual cases, this approach may lead to limited differentiation between the subvariants.
Materials
TaqMan Universal PCR Master Mix (2X)Life TechnologiesCatalog #4304437 TaqMan Exogenous Internal Positive ControlLife TechnologiesCatalog #4308323
Protocol materials
TaqMan Exogenous Internal Positive ControlLife TechnologiesCatalog #4308323
Probenvorbereitung
2 mL DNase-freies Aqua dest. in ein Reagenzglas pipettieren
Mit einem Bürstentupfer mehrere Kolonien von der MacConkey-Platte abnehmen
In Aqua dest. suspensieren und den Bürstentupfer am Reagenzglasrand ausdrücken
Vortexen und 1 ml in ein Reaktionsgefäß pipettieren
Gefäß fest verschließen und bei erreichter Temperatur von 95 °C in den Thermo-Mixer einsetzen
Im Thermo-Mixer für 10 min bei 95 °C unter Schütteln erhitzen
Anschließend bei 12.000 rpm 1 min zentrifugieren
Herstellung des Master-Primer-Mix (Vorrat)
Vor der Verwendung sind alle Primer und Sonden schonend bei 2–8 °C aufzutauen.
Aliquotieren um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.
Erstellen des Primer-Master-Mix aus den Aliquots nach folgendem Schema:
| A | B | C | |
| Vol in µl | Primer/Sonde* | Konz. | |
| 80 | Stx2a-Fwd | 10µM | |
| 80 | Stx2a-Rwd | 10µM | |
| 40* | stx2aFAM-Probe | 10µM | |
| 80 | Stx2c-Fwd | 10µM | |
| 80 | Stx2c-Rwd | 10µM | |
| 80 | stx2cCyanin-Probe | 10µM | |
| 80 | Stx2d-Fwd | 10µM | |
| 80 | Stx2d-Rwd | 10µM | |
| 80 | stx2dABY-AGT-Probe | 10µM |
*Wir setzen die Sonde für stx2a in halber Konzentration relativ zu anderen Sonden ein, um Unterschiede in der Signalstärke auszugleichen.
Sequenzen von Primern und Sonden - Assay Setup (Design als „Thermo Fisher Custom TaqMan Probes“ online)
stx2a:
Stx2a-Fwd
GGCGGATTGTGCTAAAGGTA
Stx2a-Rwd
GTTGCAGATTCCAGCGACT
Stx2aFAM-Probe
[FAM]AGGATGACACATTTACAGTGAAGGTTG[MGBEQ]
stx2c:
Stx2c-Fwd
CAGCGTTTCTGAACAGAAAGTC
Stx2c-Rwd
CTTTTACTGTGAATGTATCATTCTCATTATAC
Stx2cCyanin-Probe
[Cy5]ACAGTTTTTATATACAACGGGTAAA[QSY2]
stx2d:
Stx2d-Fwd
TATGGGAAAGTAATACAGCAGCAG
Stx2d-Rwd
CCGCCATAAACATCTTCTTCATAC
Stx2dABY-AGT-Probe
[ABY]AGTCTTTATATACAACGGGTGAATA[QSY]
Vor Gebrauch alle Reagenzien gut mischen und kurz zentrifugieren. Vor der Verwendung wieder schonend bei 2–8 °C auftauen.
Herstellung des Mastermix
Die Anzahl der für die PCR benötigten Reaktionen ergibt sich aus der Zahl der Proben sowie einer negativen Kontrolle und einer positiven Kontrolle.
Wir nutzen als interne Amplifikationskontrolle Kontrolle TaqMan Exogenous Internal Positive ControlLife TechnologiesCatalog #4308323 mit dem VIC Fluophor.
Die einzelnen Reaktionen setzen sich wie folgt zusammen:
| A | B | |
| Vol. in µl | ||
| 10 | 2x Univ. PCR MMX | |
| 2,2 | 10x Exo IPC Mix | |
| 0,5 | 50x Exo IPC DNA | |
| 4,25 | Primer Mix | |
| 2,05 | A.dest |
Mischverhältnisse im Mastermix für eine Einzelprobe
Mastermix: In der Berechnung für mehrere Proben Pipettierverluste ausgleichen (eine zusätzliche Reaktion annehmen)!
Herstellung des PCR-Mix
Je 19 μl des Master-Mix in jede benötigte Vertiefung der PCR-Platte pipettieren
Proben zum Master-Mix pipettieren:
- Negativkontrolle: 1 μl Aqua dest.
- Positivkontrolle: 1 μl Positive Control (Mix aus Proben von Refernenzstämmen, die Stx2a, 2c, und 2d positiv sind)
- Proben: 1 μl der extrahierten Probe
PCR Programm
| A | B | C | D | E | |
| Pre-Read-Stabilisierung/UNG-Aktivierung | 50 | 2 Minuten | 1 | Messung der Grundfluoreszenz und Temperaturstabilisierung, UNG Aktivierung | |
| Initiale Denaturierung | 95 | 10 Minuten | 1 | Aktivierung der Taq-Polymerase und Denaturierung der DNA | |
| Denaturierung | 95 | 15 Sekunden | 40 | Trennung der DNA-Stränge | |
| Annealing und Elongation | 60 | 60 Sekunden | 40 | Primerbindung und DNA-Synthese durch Polymerase | |
| Endgültige Elongation | 60 | 5 Minuten | 1 | Sicherstellung vollständiger Amplifikation |
Temperaturprofil für die Hausmethode zur Subtypisierung stx2-pos. EHEC.
Die Amplifikation erfolgt im Quantstudio Pro 6 Thermal Cycler.
Für andere Labore: Bei der Verwendung eines anderen Systems ist darauf zu achten, dass die VIC, FAM, Cy5 und ABY Kanäle getrennt werden können.
Auswertung
| A | B | C | D | E | F | |
| stx2a | stx2c | stx2d | ICD* | Ergebnisdetail (intern)** | Ergebnis (Befund)*** | |
| positiv | negativ | negativ | positiv / negativ | Hochrisikovariante (stx2a) nachweisbar | Hochrisikovariante (Stx2a, 2c oder 2d) positiv | |
| positiv | positiv | negativ | positiv / negativ | Hochrisikovariante (stx2a oder [stx2a und 2c]) nachweisbar | Hochrisikovariante (Stx2a, 2c oder 2d) positiv | |
| negativ | positiv | negativ | positiv / negativ | Hochrisikovariante (stx2c) nachweisbar | Hochrisikovariante (Stx2a, 2c oder 2d) positiv | |
| negativ | negativ | positiv | positiv / negativ | Hochrisikovariante (Stx2d) nachweisbar | Hochrisikovariante (Stx2a, 2c oder 2d) positiv | |
| positiv | positiv | positiv | positiv / negativ | Hochrisikovarianten ([stx2a und 2d] oder [stx2a, 2c und 2d]) nachweisbar | Hochrisikovariante (Stx2a, 2c oder 2d) positiv | |
| negativ | positiv | positiv | positiv / negativ | Hochrisikovarianten (stx2c und 2d) nachweisbar | Hochrisikovariante (Stx2a, 2c oder 2d) positiv | |
| negativ | negativ | negativ | positiv | Hochrisikovarianten (Stx2a, 2c, 2d) nicht nachweisbar | Hochrisikovariante (Stx2a, 2c oder 2d) nicht nachweisbar | |
| negativ | negativ | negativ | negativ | ungültig | Nicht möglich** |
* Bei positiven Proben können negative interne Kontrollen toleriert werden. Starke positive Signale können die ICR überstrahlen.
** Die Methode detektiert die drei Hochrisikovarianten 2a, 2c und 2d des Stx2 Virulenzfaktor zuverlässig in klarer Abgrenzung zu anderen Varianten mit niedrigerem Risiko. Die Methode unterscheidet allerdings nicht in allen Fällen zwischen Stx2a und 2c.
*** Eine Testung ist ungültig, wenn sowohl die Probe-DNA als auch die Internal Control DNA keine Amplifikation im Nachweissystem zeigen. In der Probe sind ggf. PCR-Inhibitoren vorhanden. Die extrahierte Probe sollte 1:10 mit PCR-Wasser verdünnt und erneut amplifiziert werden oder es sollte die Lyse und Reinigung der Probe wiederholt werden. Falls die Amplifikation wiederholt fehlschlägt wird die Probe mit dem Befund "Nicht möglich" freigegeben.
Befundkommentar
Zur Information der Gesundheitsämter nutzen wir folgenden Kommentar:
„Die stx2-Subtypisierung detektiert die drei Hochrisikovarianten 2a, 2c und 2d des Shigatoxin-Gens stx in Abgrenzung zu anderen Varianten mit niedrigerem Risiko von HUS (siehe EHEC: Überarbeitung der RKI-Empfehlungen für die Wiederzulassung zu Gemeinschaftseinrichtungen gemäß § 34 IfSG nach EHEC-Infektion, Epid Bull 47/2019)“.
Protocol references
Harada, T., Wakabayashi, Y., Seto, K., Lee, K., Iyoda, S., & Kawatsu, K. (2023). Real-time PCR assays to detect 10
Shiga toxin subtype (Stx1a, Stx1c, Stx1d, Stx2a, Stx2b, Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f, and Stx2g) genes. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 105(3), 115874.
EHEC: Überarbeitung der RKI-Empfehlungen für die Wiederzulassung zu Gemeinschaftseinrichtungen gemäß § 34 IfSG nach EHEC-Infektion, Epid Bull 47/2019