Nov 04, 2020

Public workspace Rotina de Manutenção e Infecção de Células C6/36_v2

This protocol is a draft, published without a DOI.
  • 1UFRJ
  • PlasmoVet
Fabio Gomes
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Protocol Citation: Fabio Gomes 2020. Rotina de Manutenção e Infecção de Células C6/36_v2. protocols.io https://protocols.io/view/rotina-de-manuten-o-e-infec-o-de-c-lulas-c6-36-v2-bm2mk8c6
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License,  which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: In development
We are still developing and optimizing this protocol
Created: October 05, 2020
Last Modified: November 04, 2020
Protocol Integer ID: 42797
Abstract
Protocolo de Manutenção de Infecção (DENV e ZIKV) de Células C6/36 - PLO

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Protocolo DENV.pdf
1.1MB
Materials
MATERIALS
ReagentPenicillin-StreptomycinGibco - Thermo FisherCatalog #15140122
ReagentFetal Bovine Serum, qualified, BrazilThermo FisherCatalog #12657029
ReagentTrypsin-EDTA (0.5%), no phenol redThermo FisherCatalog #15400054
ReagentLeibovitz's L-15 Medium, powderThermo FisherCatalog #41300039
ReagentTryptose Phosphate BrothSigma AldrichCatalog #T9157
Tripsinização Cultura
Tripsinização Cultura
4m
4m
Pre-aquecer o meio e PBS 1x
De uma garrafa (25cm2) com 90% de confluência, remover o meio e lavar com 5 mL PBS (2)

Acrescentar 1 mL tripsinaDuration00:00:00

3m
Deixar agir por 1 min e acompanhe em microscopioDuration00:01:00

1m
Paralisar a reação adicionando 7 mL meio
Preparo de Garrafas para Infecção
Preparo de Garrafas para Infecção
Contar células e passar em diluição 1:10 para garrafar de 225cm2
Deixar crescer até 50-70% de confluência (48-72h)
Remover meio de cultura e lavar com 10 mL PBS
Adicionar 10mL 0.25% Tripsina
Contar células e calcular para infecção com MOI-0.1
Infecção
Infecção
Adicionar o inóculo do vírus em meio L15 (sem soro), completando volume em 10 mL
Manter a 28oC por 1 hora,Duration01:00:00


A cada 15 min, mexa a garrafa de cultura para banhar a camada de célulasDuration00:15:00

Descartar o meio com vírus e acrescentar 15mL meio (2% FBS, PenStrep, L15)
Manter a cultura na estufa a 28oC por até 9 dias. Não mover as garrafas! Duration168:00:00

Processamento Vírus
Processamento Vírus
Recolher o meio e ajustar o pH usando 7,5% bicarbonato de sódio
Adicionar FBS até a concentração final 20%
Centrifuga 300g por 10 min
Filtrar com membrana de 0.22 µm
Aliquotar (500 µl) e manter em -80oC