May 17, 2020
Quantification de la callose dans les filaments de P. patens par microscopie confocale
- Yoan Coudert1,
- Arthur Muller1
- 1Ecole Normale Supérieure de Lyon
Protocol Citation: Yoan Coudert, Arthur Muller 2020. Quantification de la callose dans les filaments de P. patens par microscopie confocale. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bghejt3e
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
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Created: May 17, 2020
Last Modified: May 17, 2020
Protocol Integer ID: 37126
Before start
Protocole pour microscope Leica TCS SP8
Culture
Culture
Faire une culture de colonie sur milieu BCD (AT) pendant 15 jours en boîte carrée (10 x 10 cm)
Aniline blue staining
Aniline blue staining
Préparer la solution de travail en diluant la solution stock d’aniline bleu 1:3 (v :v) dans du tampon phosphate pH 8,5
Remplir les puits d’une plaque 48 puits avec 200µL de la solution de travail d’aniline bleu
Prélever une petite quantité de protonema à la périphérie des colonies et la placer dans les puits de la plaque 48-puits
Laisser les tissues dans la solution d’aniline bleu 30 minutes à 23°C et à l’obscurité
Rincer les échantillons à l’eau
Placer les échantillons sur lame dans une d’iodure de propidium puis déposer une lamelle
Confocal imaging
Confocal imaging
Vérifier l’échantillon à la binoculaire
Régler les paramètres du microscope cf Paramétrage du microscope Leica TCS SP8
Localiser l’échantillon sur la lame au grossissement x 5 (air)
Observer l’ensemble de l’échantillon au grossissement x 25 puis x 40 (eau)
Définir le nombre de tiles et leurs espacements pour l’acquisition d’images cf Paramétrage du microscope Leica TCS SP8
Faire acquisition de la paroi entre la cellule apicale et la cellule sub-apicale (50 réplicats biologiques)
A partir des z-stack utiliser la fonction projection maximale pour obtenir l'image finale
Sauvegarder fréquemment le projet
Traitement des images avec Fiji software
Traitement des images avec Fiji software
Dupliquer les images (raccourci commande + maj + D)
Changer le contraste pour toutes les images Image>Adjust>Contrast>Set
Mettre Minimum displayed value : 0 et maximum displayed value : 4095 en 12 bit
Appliquer les fausses couleurs : Image>Lookup tables>Fire
Ouvrir le ROI T1 (modèle 360 µm2) dans le gestionnaire de ROI : analyze>tools>ROI manager
Déplacer la ROI dans un coin où il n’y a pas de signal et mesurer la somme de l’intensité des pixels de la ROI = signal bruit de fond :
analyze>set measurments>cocher integrated density
analyze>measure (cntrl + m)
RawIntDens
Positionner la ROI au niveau de la paroi entre la cellule apical et sub-apical et mesurer la somme de l’intensité des pixels de la ROI = signal callose brut
Signal callose brut – signal bruit de fond = signal callose
Procéder de la même façon pour tous les échantillons
Enregistrer les données dans un tableur excel
Analyses statistiques
Analyses statistiques
Dans un premier temps pour visualiser les données faire un box plot avec les différentes conditions traités
Paramétrage du microscope LEICA TCS SP8
Paramétrage du microscope LEICA TCS SP8
Lasers
| Type laser | % | |
| Laser diode UV 405 nm (callose) | 10% | |
| Laser visible 488 nm (PI) | 9% à 15% |
Détecteurs
| Détecteur | Observation | Gain | Offset | Intervalle nm | |
| PMT 2 | callose | 670 | 0,1% | 440-520 nm | |
| PMT4 | autofluo chloroplaste | 550 | 0,1% | 600-720 nm | |
| PI | 560-615 nm |
Stack
- Nombre de tiles : 30
- Espacement entre les tiles : 0,70
Autres
- Grossissement : x 40
- Zoom : 1,5
- Pinhole airy : 1
- Frame average : 8
- Scan speed : 8 000 hz
- Définition de l’image : 1024x1024
- Bit : 12
Aniline blue
λex 390 nm
λem 480 nm
PI
λex 493 nm
λem 636 nm