Oct 19, 2017
Version 2
Protocolo de extracción de PBMCs por densidad con iodioxanol V.2
- 1Centro de Investigaciones Biomédicas - Universidad del Quindío;
- 2Centro de investigaciones biomédicas. Universidad del Quindío.
- Grupo de inmunología molecular
Protocol Citation: Lily Johanna Toro, Germán lberto Téllez Ramírez, Diana Carolina Henao, Jhon Carlos Castaño Osorio 2017. Protocolo de extracción de PBMCs por densidad con iodioxanol
. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.kdmcs46
Manuscript citation:
Tomado de (http://www.axis-shield-density-gradient-media.com/C03.pdf) Isolation of mononuclear cells from human blood by sedimentation on to a density barrier. Application sheet C03.
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
Created: October 19, 2017
Last Modified: March 28, 2018
Protocol Integer ID: 8333
Keywords: Células Mononucleares de Sangre Periferica, Inmunología, Plasma, Barrera de densidad. , pbmcs por densidad con iodioxanol, pbmc, la interfase los pbmc, procedimiento basado en la sedimentación, la sedimentación, proyecto 111356933173 convocatoria569
Abstract
Procedimiento basado en la sedimentación a través de una barrera de densidad de 1,077g/ml dejando en la interfase los PBMCs.
La realizacion de este protocolo fue posible gracias al apoyo del departamento administrativo de ciencia tecnología e innovacion, Colciencias a traves del proyecto 111356933173 convocatoria569-2012.
Guidelines
Para aislar Celulas Mononucleares de Sangre Periferica (PBMCs), extraer 4 mL de sangre de una persona voluntaria sana. Bajar la densidad de la sangre y sedimentar por centrifugación en una barrea de densidad a1.077g/mL. La intefase que contiene los PBMCs se extrae y se diluye en solucion A 1:1 y se centrifuga a 150 g por 10 minutos; el pellet celular es resuspendido en medio de cultivo (RPMI 1640, Antibiotic antimicotic 1X).
Las celulas son cultivadas por 12 horas antes del ensayo a 37 ºC y 5 %CO2.
Materials
STEP MATERIALS
RPMI 1640 MediumThermo Fisher ScientificCatalog #11875093
Optiprep ( Iodixanol)Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #D1556-250ML
10 mM HEPES (pH 7.5)
0.1 M NaOH
NaClMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #53014
RPMI 1640 MediumThermo Fisher ScientificCatalog #11875093
Optiprep ( Iodixanol)Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #D1556-250ML
10 mM HEPES (pH 7.5)
0.1 M NaOH
NaClMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #53014
Protocol materials
0.1 M NaOH
10 mM HEPES (pH 7.5)
NaClMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #53014
RPMI 1640 MediumThermo Fisher ScientificCatalog #11875093
Optiprep ( Iodixanol)Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #D1556-250ML
Safety warnings
Tener especial cuidado en la manipulación de la sangre (doble guante, tapabocas y gafas de protección).
Before start
Prepare la solución A con materiliales libres de LPS.
Quite el freno de la centrifuga y organice el programa con el que va a trabajar (700 g - 20 minutos - temperatura ambiente - SIN FRENO).
Preparación de Soluciones
Sln A: Optiprep: iodixanol 60% =1,32g/mL (agitar gentilmente antes de usar)
Sln B: Hepes buffer salino= NaCL 0,85% p/v, Hepes 10mM – NaOH pH7,4.
Para 50mL: pesar 0,425g de NaCl y 0,119g de Hepes diluir hasta 45mL y ajustar pH a 7,4 con NaOH (aprox 20-25µl 5M). llevar a 50ml y filtrar por 0.22µm.
Barrera con densidad: 1,077g/mL = 5 Vlns Sln A + 17 Vlns Sln B
1,077g/mL = 2,5mL Sln A + 8,5mL Sln B= 11mL
Medio de cultivo: 20 mL de medio RPMI 1640 con antibiótico antimicótico 1X.
RPMI 1640 MediumThermo Fisher ScientificCatalog #11875093
Optiprep ( Iodixanol)Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #D1556-250ML
10 mM HEPES (pH 7.5)
0.1 M NaOH
Note
A partir de 6mL de sangre se obtienen aproximadamente 8 millones de PBMCs.
NaClMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #53014
01:00:00
Procedimiento
- Tomar sangre de un paciente saludable con EDTA (1,5-2mM EDTA) y hacer una dilución 1:1 en Sln B (Ej: para 3mL de sangre, adicionar 3mL de Sln B).
- Adicionar 3 mL de la barrera de densidad (1,077g/mL) en un tubo de 15mL limpio y encima (muy lentamente) adicionar 6mL de la muestra diluida.
- Centrifugar a 700g por 20 min. (temperatura ambiente y SIN FRENO)
- Tomar la interfase mediante punción del tubo de 15mL con una jeringa de 21G con el bisel mirando hacia arriba, o por pipeteo con pipeta pasteur (Ver figura 1).
- Diluir las celulas colectadas a una relacion 1:1 con Sln B.
- (Opcional para remover exceso de plaquetas): Centrifugar a 150g por 10 min temp ambiente, tomar el pellet y resuspenderlo en 2mL aproximadamente de RPMI con antibiótico 1X.
- Para la cuantificación de los PBMCs en la cámara de neubauer, hacer una dilución 1:16 con medio de cultivo y al final con azul tripan (Ej: 10µL de RPMI + 10µL de PBMCs= 20µL (1:2) de estos 10µL de RPMI + 10µL (1:2)= 20µL (1:4) de estos 10µL de RPMI + 10µL (1:4)= 20µL (1:8) de estos 10µL de azul tripan + 10µL de (1:8)= 20µL 1:16 tomar 10µL y leer en cámara).
Celulas/mL= (total células contadas/4)*10000*factor de dilución
Celulas/mL= (total células contadas/4)*10000*16.
- Sembrar 200.000-250.000 PBMCs (células/pozo) en placa de 96 pozos. o en cajas de cultivo T25 o T75.
01:00:00