Jun 30, 2025
Inmuno directa η-caderina (eta caderina, e caderina) (AF488)
- Cristian Hernández1
- 1None
Protocol Citation: Cristian Hernández 2025. Inmuno directa η-caderina (eta caderina, e caderina) (AF488). protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.261gekp4yg47/v1
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working (:
Created: June 30, 2025
Last Modified: June 30, 2025
Protocol Integer ID: 221278
Keywords: IHC, immunohistochemisty, antigen, assay, protocol, AF488, fluorescence, microscopy, e-cadherin, cadherin conjugate antibody, bioprinted tissue, fluorescent microscope, engineered sample, antibody, proteins in cells alight green, assay, binding protein, trujillo lab, eta caderina, protein, cell
Abstract
Complete protocol for 3D bioprinted tissue engineered samples from Álvarez-Trujillo Lab using SC8426 E-cadherin conjugate antibody with AF488. Samples processed as this are to be seen on a fluorescent microscope. Binding proteins in cells alight green.
Direct immuno fluorescent assay E-cadherin (AF488) for 3D constructs
Image Attribution
Cristian Hernández
Guidelines
This is a non sterile protocol, but care must be taken as some of the reagents are toxic. If you're unfamiliar with the protocol you should proccess one sample at a time to avoid missing steps and ruining the assay.
Materials
- PBS o HBSS dependiendo de la aplicación
- Paraformaldehído 4 % preparado en PBS filtrado
- Tritón-X 0.1 % preparado en PBS
- (Opcional) Buffer de almacenamiento: Azida de sodio 0.1 % en PBS
- (Opcional) Citrato de sodio pH 6
- (Opcional)Buffer PIER: 1 mL CaCl2 1 % + 1 mL Tripsina 0.5 % + 8 mL Agua destilada pH 7.8
- Albúmina sérica bovina (BSA) 10 % preparada en PBS
- Tween-20 0.1 % diluído en PBS
- Anticuerpo primario conjugado E-cadherina con AF488 (verde) SC8426
- Micropipeta 1000 µL
- Micropipeta 200 µL
- Micropipeta 20 µL
- Baño de agua
- Papel aluminio
- Refrigerador
- Microscopio óptico de fluorescencia
- Fasco para RPBI líquido
- Contenedor de PRBI sólido
- Amor
Protocol materials
HBSSThermo Fisher Scientific
PBS (1X)Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)
Paraformaldeído PBS
Tritón-X PBS
Tween 20 PBS
Albúmina sérica bovina (BSA)
VECTASHIELD® Vibrance™ Antifade Mounting Medium H-1700 Vector LaboratoriesCatalog #H-1700-10
E-cadherin AF488Santa Cruz BiotechnologyCatalog #sc-8426
Troubleshooting
Safety warnings
El paraformaldehído es toxico y emana vapores, evitar la exposición no controlada.
El RPBI deberá ser diluído con cloro antes de desecharlo.
Before start
Este es un protocolo largo, hay que asegurarse de que se cuenta con el suficiente tiempo y todos los reactivos estén preparados desde el principio. Aplicar demasiado calor a alguno de los pasos que así lo requieran va a arruinar la muestra. El paraformaldehído es tóxico y debe manejarse con precaución.
Las tinciones de proteínas de adhesión no se permeabilizan.
El nombre del antígeno es η-caderina, letra griega eta, no confundir con la n-caderina, letra latina n. La mayoría de la gente lo llama "e-caderina", pero si quieres farolear "eta caderina" suena muy padre.
Checklist de reactivos y material
PBS (1X)Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) o HBSSThermo Fisher Scientific
Paraformaldeído PBS (4 % preparado en PBS filtrado)
Tritón-X PBS (0.1 % preparado en PBS)
(Opcional) Buffer de almacenamiento:
Azida de sodio 0.1 % en PBS
(Opcional) Citrato de sodio 6 .
(Opcional)Buffer PIER:
1 mL CaCl2 1 %
1 mL Tripsina 0.5 %
8 mL Agua destilada pH 7.8
Albúmina sérica bovina (BSA) 10 % preparada en PBS.
Note
No agitar excesivamente al preparar. (Por las burbujas this is, it's not like its gonna degrade, just lose quality innit)
Tween 20 PBS (0.1 % diluído en PBS)
Anticuerpo primario conjugado E-canherin con AF488 (verde) SC8426
E-cadherin AF488Santa Cruz BiotechnologyCatalog #sc-8426
- Micropipeta 1000 µL
- Micropipeta 200 µL
- Micropipeta 20 µL
- Baño de agua
- Papel aluminio
- Refrigerador
- Microscopio óptico de fluorescencia
- Fasco para RPBI líquido
- Contenedor de PRBI sólido
- Amor
Determinar el caso a seguir en la inmuno dependiendo de la muestra.
Tinción a fibra23 steps
Cuando la inmuno debe ser realizada en fibras tridimensionales de máximo 1 mm de grosor (K4E3L)
Preparación de la muestra
14m
De ser posible, mover la muestra a un recipiente libre de material biológico.
Note
Utilizar una punta de micropipeta (sobretodo las de 200 µL y 10 µL) hará que las fibras se partan. Es recomendable usar una o múltiples cucharas o espátulas anguladas o una punta de micropipeta de succión.
6m
Lavar 3 veces la muestra con Hanks (HBSSThermo Fisher Scientific ) a temperatura ambiente, en intérvalos de 00:05:00 . Sin aspirar la fibra.
5m
De ser posible, alejar la fibra de las orillas del recipiente.
Note
No es imperante realizar este paso, puesto que la refracción de la fluorescencia no se ve afectada al ser luz reflejada desde el fondo del microscopio, sin embargo, no será posible obtener imágenes consistentes en Campo Claro.
2m
Retirar la solución de lavado restante. Sin aspirar la fibra.
Evitar que la fibra se deshidrate.
1m
Fijado
37m 30s
Manejar el paraformaldehído (PFA) con cuidado.
Safety information
Emite vapores tóxicos e irritantes de la vía aérea. Desechar los guantes posterior a su manipulación.
Colocar una cantidad de Paraformaldeído PBS a temperatura ambiente buena para cubrir y sumergir completamente la muestra.
Note
Menos PFA puede ocasionar hipofijación y más células sueltas circulares al final.
30s
Fijar durante mínimo 00:20:00 a temperatura ambiente en un entorno sin humedad protegido de la luz.
20m
Lavar 3 veces la muestra con PBS (1x) a temperatura ambiente, en intérvalos de 3 minutos.
12m
(Opcional) Si la tinción no se hace inmediatamente se puede almacenar de 1 a 2 semanas a 4° humectando el constructo con el buffer de almacenamiento.
5m
El siguiente paso es el bloqueo, sin permeabilizar.
Note
Las tinciones de proteínas de adhesión NO SE PERMEABILIZAN. La acción surfactante de las soluciones deshace la membrana.
Bloqueo
1h 31m 30s
Colocar una cantidad de Albúmina sérica bovina (BSA) a 37 °C buena para cubrir y sumergir completamente la muestra.
30s
Incubar durante mínimo 01:30:00 a temperatura ambiente
1h 30m
Lavar la muestra con PBS (1x) a temperatura ambiente, para remover el exceso de BSA. Sin aspirar la muestra.
1m
Utilizar la dilución estándar de Cristian para anticuerpo primario (pAb) de 1:150 para diluir en Tween 20 PBS
Note
No realizar más de 1 mL de solución de anticuerpo a la vez puesto que solo dura 1 semana fuera de su vial original
1m
Tinción de mismo día9 steps
Cuando la tinción se va a observar en el microscopio durante el mismo día que se tiñó
Añadir o distribuir toda la dilución de pAb en la muestra
Note
Para placas de 6 pozos o petris de 35 mm (las bebés) 300 µL son suficientes para impregnar todo el fondo, pero 500 µL son recomendados para una fibra estándar de 1 mm
30s
Incubar durante mínimo 03:00:00 a temperatura ambiente completamente cubierto de la luz.
3h
Lavar 3 veces la muestra con PBS (1x) a temperatura ambiente, en intérvalos de 3 minutos. Sin aspirar la muestra.
Note
Al ser agentes surfactantes (jabón) el tritón y el tween generan espuma. El lavado deberá remover la espuma
12m
Preparar la muestra para el microscopio.
Note
Si se planea tomar campo claro es recomendable dejar la fibra hidratada, no nadando.
Microscopio
19m
Colocar el soporte adecuado para el contenedor donde se realizó la tinción y fijarlo a la platina.
3m
Seleccionar el canal AF488 y el objetivo 2.5x
Note
La fluorescencia generalmente es débil en el objetivo 2.5x, pero se utiliza para escoger la dirección general de la señal puesto que hacer barridos de búsqueda es mucho más laborioso utilizando el objetivo 10x
1m
Realizar la adquisición de la muestra. 00:15:00 por muestra
Note
Si bien el ApoTome no puede proveer la definición esperada en Optical Sectioning, configurarlo a Conventional Fluorescence contribuye a la mejora notable de la calidad de imagen a costa de un tiempo de adquisición de más del triple.
Note
Para guardar una imágen de ApoTome primero se tiene que generar como imagen dentro de las opciones del ApoTome en la cintilla inferior derecha. El nuevo archivo debe contener el sufijo "ApoTome" (ej. Snap-XXXX-ApoTome).
Note
Favorecer intensidades del led bajas y tiempos de exposición altos para evitar el velado de la muestra
Note
Dar prioridad a tomar imágenes de fluorescencia sobre las de brightfield
Note
El ApoTome no puede tomar imágenes de campo claro
15m
Almacenamiento/Desecho
Las muestras teñidas pueden ser montadas con agente fijador de fluoróforo VECTASHIELD® Vibrance™ Antifade Mounting Medium H-1700 Vector LaboratoriesCatalog #H-1700-10
para almacenar durante semanas a temperatura ambiente.
Si las muestras no serán usadas pueden ser descartadas en RPBI
Protocol references
https://www.scbt.com/p/e-cadherin-antibody-g-10