Aug 13, 2024
Fluorescent gelatin degradation protocol in 96-well plates
- Bianca Cruz Pachane1
- 1Universidade Federal de São Carlos - UFSCar
Protocol Citation: Bianca Cruz Pachane 2024. Fluorescent gelatin degradation protocol in 96-well plates. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.8epv5rmz6g1b/v1
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
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Created: August 07, 2024
Last Modified: August 13, 2024
Protocol Integer ID: 104905
Keywords: Gelatina Fluorescente, Invasão Celular, fluorescent gelatin degradation protocol, ensaio de degradação de gelatina fluorescente, detecting gelatinase activity, gelatinase activity, avaliação da atividade gelatinase, epifluorescence microscopy analysis, microscopy analysis, studying cell invasion, epifluorescence, por análise de microscopia epifluorescente, fluorescent, cell invasion, cell
Funders Acknowledgements:
FAPESP
Grant ID: 2021/01983-4
Disclaimer
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Abstract
Protocolo do ensaio de degradação de gelatina fluorescente, método de estudo da invasão celular que permite a avaliação da atividade gelatinase in vitro por análise de microscopia epifluorescente. Adaptado de Pachane et al (2022) para placas de 96 poços.
Fluorescent gelatin degradation protocol, a method for studying cell invasion by detecting gelatinase activity in vitro upon epifluorescence microscopy analysis. Adapted from Pachane et al (2022) (PMID: 36293503)
Guidelines
Descongelar a gelatina a 37 ºC, protegida da luz. Todo o trabalho no fluxo deve ser realizado com a luz da capela apagada (luz ambiente pode estar acesa). Uma vez que o ensaio for finalizado, selar a placa com Parafilm M e deixa-la na geladeira (4 ºC) embalada em papel alumínio até a análise.
Materials
Consumíveis
- Placa de 96 poços preta com fundo chato transparente estéril -Corning® 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates, Individually WrappedCorningCatalog #3603
- Pipetas e tubos estéreis
Soluções:
- Gelatina conjugada com fluoresceína -Gelatin From Pig Skin, Fluorescein ConjugateThermo FisherCatalog #G13187
- PBS estéril (autoclavado e/ou filtrado)
- Meio de cultivo sem soro
- Meio de cultivo com soro
- Trypan blue -Trypan Blue solution 0.4%Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #T8154- 100 ml
- PFA (paraformaldeído4 % (w/v) em H2O deionizada , 7.6 ) - filtrar e manter estéril
- Triton X-100 (0.1 % (v/v) em H2O deionizada ) - não filtrar
- Faloidina + DAPI (1 µL Phalloidin-iFluor 647 ReagentAbcamCatalog #ab176759 + 0.76 µL 4,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)Thermo Fisher ScientificCatalog #D1306 em 5 mL PBS )
Equipamentos
- Capela de fluxo laminar
- Incubadora para células
- Contador de células
Equipment
new equipment
NAME
Bio-Rad
BRAND
1450011
SKU
Cell Counting Slides for TC10™/TC20™ Cell Counter, Dual-Chamber
SPECIFICATIONS
4. Microscópio de Epifluorescência
Equipment
ImageXpress Micro XLS+
NAME
HTS epifluorescence microscope
TYPE
Molecular Devices
BRAND
500496
SKU
Protocol materials
Gelatin From Pig Skin, Fluorescein ConjugateThermo FisherCatalog #G13187
Trypan Blue solution 0.4%Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #T8154- 100 ml
Corning® 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates, Individually WrappedCorningCatalog #3603
Phalloidin-iFluor 647 ReagentAbcamCatalog #ab176759
4,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)Thermo Fisher ScientificCatalog #D1306
Parafilm™ M Laboratory Wrapping Film, 4 in. W x 125 ft. L; (10cm x 38m)Thermo FisherCatalog #1337410
Safety warnings
Trabalhar sob condições estéreis em ambiente sem iluminação direta para proteger a fluorescência da gelatina.
Ethics statement
n/a
Before start
Sob condições estéreis, solubilizar a gelatina fluorescente a 37 °C com PBS morno, conforme o datasheet, para uma solução estoque de 5 mg/mL . Aliquotar e manter os estoques congelados a -20 °C . Descongelar o estoque a 37 °C por 00:30:00 antes do uso. Para solução de uso, diluir a solução estoque para 0.2 mg/mL com PBS morno, misturar bem e manter a 37 °C até o uso.
Preparação da Placa Recoberta com Gelatina Fluorescente
Descongelar estoque de Gelatina Fluorescente a 5 mg/mL ou solução de uso a 0.2 mg/mL por 00:30:00 a 37 °C (estufa ou banho-maria).
Gelatin From Pig Skin, Fluorescein ConjugateThermo FisherCatalog #G13187
30m
Preparar a solução de uso com PBS morno e mante-la a 37 °C até o uso.
Dentro do fluxo, sob condições estéreis, abrir uma nova placa preta de 96 poços e nomear os grupos conforme o mapa experimental, que deverá conter pelo menos:
- Controle negativo - células em meio sem soro, sem tratamento
- Controle positivo - células em meio com soro, sem tratamento
- Tratamento
OBS: planejar ensaio para conter três replicatas técnicas pelo menos.
Corning® 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates, Individually WrappedCorningCatalog #3603
Aplicar 70 µL da solução de uso de gelatina fluorescente (0.2 mg/mL ) diretamente no fundo de cada poço, com as pipetas a 90º em relação ao fundo da placa. Evitar a formação de bolhas ao dispensar o líquido.
Incubar a placa por 00:30:00 em estufa a 37 °C , protegido da luz, para polimerização da gelatina.
30m
Remover o excesso de coating da placa por pipetagem ou aspiração (evitar tocar no fundo do poço).
Pré-condicionar a placa com 200 µL do meio de plaqueamento adequado por 00:30:00 em estufa a 37 °C :
- Controle negativo: meio sem soro
- Controle positivo: meio com soro
- Tratamento: meio sem soro
30m
Preparação e Plaqueamento do Ensaio
2d 16h
Repicar as células como de costume. Ressuspender células em meio sem soro para contagem automatizada com trypan blue.
Trypan Blue solution 0.4%Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #T8154- 100 ml
Equipment
new equipment
NAME
Bio-Rad
BRAND
1450011
SKU
Cell Counting Slides for TC10™/TC20™ Cell Counter, Dual-Chamber
SPECIFICATIONS
Remover o meio de pré-condicionamento da placa por pipetagem ou aspiração (evitar tocar no fundo do poço).
Adicionar meio de plaqueamento + suspensão de células + tratamento para um volume total de 200 µL . Efetuar o plaqueamento individualizado por poço.
Densidades sugeridas:
MDA-MB-231: 5x103 células/poço (= 1x105 células/ml)
HUVEC: 5x103 células/poço (= 1x105 células/ml)
HDFa: 2x103 células/poço (= 1x104 células/ml)
THP-1: 5x103 células/poço (= 1x105 células/ml)
MCF7: 5x103 células/poço (= 1x105 células/ml)
Incubar a placa em estufa a 37 °C , 5% CO2, por 16:00:00 a 48:00:00 .
2d 16h
Fixação e Marcação das Células
10m
Ao final da incubação, remover o meio condicionado da placa. O meio pode ser descartado ou coletado para avaliação de gelatinases por zimografia.
Fixação: Adicionar gentilmente 100 µL PFA 4% em cada poço e incubar em Room temperature (RT) por 00:10:00 .
10m
Lavar os poços gentilmente com 100 µL PBS . Descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem.
Permeabilização: Adicionar gentilmente 100 µL 0.1% Triton X-100 por poço e incubar em Room temperature (RT) por exatamente 00:05:00 .
5m
Lavar os poços gentilmente com 100 µL PBS . Descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem.
Marcação: adicionar 70 µL Faloidina + DAPI por 00:20:00 em Room temperature (RT) , protegido da luz.
Phalloidin-iFluor 647 ReagentAbcamCatalog #ab176759
4,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)Thermo Fisher ScientificCatalog #D1306
20m
Lavar os poços gentilmente com 100 µL PBS . Descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem.
Manter as amostras em 200 µL PBS . Selar a placa com Parafilm M e embalar com papel alumínio.
Parafilm™ M Laboratory Wrapping Film, 4 in. W x 125 ft. L; (10cm x 38m)Thermo FisherCatalog #1337410
Imageamento por microscopia de epifluorescência
Equipment
ImageXpress Micro XLS+
NAME
HTS epifluorescence microscope
TYPE
Molecular Devices
BRAND
500496
SKU
No software MetaXpress, utilizar o template para placa Corning 3603. Serão utilizados os filtros DAPI (núcleo), FITC (gelatina) e Cy5 (faloidina 647).
Ajustar a intensidade do laser, iniciando a partir de 10 ms e aumentando gradativamente
Lembrete: intensidades muito altas podem queimar a amostra e a fluorescência é perdida mais facilmente.
Verificar a dispersão das células no poço com a lente de 4X. Não é necessário adquirir essa etapa.
Ajustar o foco para aquisição das imagens em lentes de 20X e 40X. Selecionar pelo menos 9 sítios por poço.
Após a aquisição, exportar os dados brutos para um HD ou pen drive formatado:
1. Anotar o mapa e nome da placa, junto de seu código no MetaXpress.
2. Screening > Plate Data Utilities > Export Images > selecionar a placa desejada > Select
3. Selecionar o drive externo > OK
Desligar o sistema e guardar a placa pós-análise embalada em papel alumínio a 4 °C (geladeira) .
Processamento de imagens - Degradação da Gelatina
Abrir o software FIJI
Software
ImageJ/Fiji
NAME
Windows 7
OS
National Institutes of Health
DEVELOPER
SOURCE LINK
Arrastar o arquivo bruto em formato .HTD para o FIJI. Elas devem ser importadas através do BioFormats conforme a imagem abaixo:
Todas as imagens da placa adquirida irão ser importados de uma única vez. Caso a placa seja muito pesada, você pode selecionar sítio por sitio, realizando uma importação a cada vez.
A escala das imagens já deverá estar ajustada. Caso contrário, efetuar o ajuste da escala das imagens:
Menu Analyze > Set scale >
Para 4x: 500 px = 800 µm
Para 10x: 600 px = 400 µm
Para 20x: 600 px = 200 µm
Para 40x: 600 px = 100 µm
Para 60x: 480 px = 50 µm
>
Ajustar as medidas do sistema:
Menu Analyze > Set Measurements > √ Area > √ Standard Deviation > √ Shape Descriptor > √ Mean grey value > √ Perimeter > √ Display label > OK
As imagens virão agrupadas em stacks contendo todos os filtros de um sítio, em formato 16-bit (escala de cinza).
Para agrupar todos os sítios em um único arquivo:
Menu Image > Stacks > Tools > Concatenate >
Na aba Concatenator > √ All open windows > Renomear > OK
Para selecionar o filtro FITC:
Menu Image > Colors > Split channels
Minimizar os stacks referentes ao DAPI (C1) e ao Cy5 (C3). Manter apenas o stack do FITC (C2).
Para transformar a imagem 16-bit em binária:
Menu Image > Adjust > Threshold >
Na aba Threshold > √ Don't reset range > Ajustar a máscara para conter apenas os pontos de degradação > Apply
Na aba Convert Stack to Binary > √ Black background (of binary masks) > √ Create new stack > OK
Para medir a área de degradação:
Menu Analyze > Analyze Particles
Na aba Analyze Particles > Size (micron^2) = 5-Infinity > √ Summarize > OK
Na aba Process stack? > Process all images? > Yes
A tabela contendo o resumo de cada imagem do stack será criada pelo sistema e pode ser salva como arquivo de texto .csv.
Menu File > Save as > Selecionar a pasta > Save
A área total será mostrada em µm2. Os arquivos de texto podem ser compilados no Excel para organização dos dados e análise estatística.
Processamento de Imagens: Contagem de Células
Abrir o software FIJI
Software
ImageJ/Fiji
NAME
Windows 7
OS
National Institutes of Health
DEVELOPER
SOURCE LINK
Arrastar o arquivo bruto em formato .HTD para o FIJI. Elas devem ser importadas através do BioFormats conforme a imagem abaixo:
Todas as imagens da placa adquirida irão ser importados de uma única vez. Caso a placa seja muito pesada, você pode selecionar sítio por sitio, realizando uma importação a cada vez.
As imagens virão agrupadas em stacks contendo todos os filtros de um sítio, em formato 16-bit (escala de cinza).
Para agrupar todos os sítios em um único arquivo:
Menu Image > Stacks > Tools > Concatenate >
Na aba Concatenator > √ All open windows > Renomear > OK
Para selecionar o filtro DAPI:
Menu Image > Colors > Split channels
Minimizar os stacks referentes ao FITC (C2) e ao Cy5 (C3). Manter apenas o stack do DAPI (C1).
Para transformar a imagem 16-bit em binária:
Menu Image > Adjust > Threshold >
Na aba Threshold > √ Don't reset range > Ajustar a máscara para conter os núcleos > Apply
Na aba Convert Stack to Binary > √ Black background (of binary masks) > √ Create new stack > OK
Para contagem das células:
Menu Analyze > Analyze Particles
Na aba Analyze Particles > Size (micron^2) = 10-Infinity > √ Summarize > OK
Na aba Process stack? > Process all images? > Yes
A tabela contendo o resumo de cada imagem do stack será criada pelo sistema e pode ser salva como arquivo de texto .csv.
Menu File > Save as > Selecionar a pasta > Save
O número de núcleos estará na coluna Count. Os arquivos de texto podem ser compilados no Excel para organização dos dados e análise estatística.
Processamento de Imagens: Morfologia Celular
Abrir o software FIJI
Software
ImageJ/Fiji
NAME
Windows 7
OS
National Institutes of Health
DEVELOPER
SOURCE LINK
Arrastar o arquivo bruto em formato .HTD para o FIJI. Elas devem ser importadas através do BioFormats conforme a imagem abaixo:
Todas as imagens da placa adquirida irão ser importados de uma única vez. Caso a placa seja muito pesada, você pode selecionar sítio por sitio, realizando uma importação a cada vez.
A escala das imagens já deverá estar ajustada. Caso contrário, efetuar o ajuste da escala das imagens:
Menu Analyze > Set scale >
Para 4x: 500 px = 800 µm
Para 10x: 600 px = 400 µm
Para 20x: 600 px = 200 µm
Para 40x: 600 px = 100 µm
Para 60x: 480 px = 50 µm
>
Ajustar as medidas do sistema:
Menu Analyze > Set Measurements > √ Area > √ Standard Deviation > √ Shape Descriptor > √ Mean grey value > √ Perimeter > √ Display label > OK
As imagens virão agrupadas em stacks contendo todos os filtros de um sítio, em formato 16-bit (escala de cinza).
Para agrupar todos os sítios em um único arquivo:
Menu Image > Stacks > Tools > Concatenate >
Na aba Concatenator > √ All open windows > Renomear > OK
Para selecionar o filtro Cy5:
Menu Image > Colors > Split channels
Minimizar os stacks referentes ao DAPI (C1) e ao FITC (C2). Manter apenas o stack do Cy5 (C1).
Para duplicar o filtro Cy5:
Menu Image > Duplicate
Na aba Duplicate > √ Duplicate Stack > OK
Para transformar a imagem 16-bit em binária:
Menu Image > Adjust > Threshold >
Na aba Threshold > √ Don't reset range > Ajustar a máscara para conter apenas o citoplasma das células > Apply
Na aba Convert Stack to Binary > √ Black background (of binary masks) > √ Create new stack > OK
Para separar células manualmente:
Selecionar a ferramenta conta-gotas
Clicar com o botão direito do mouse > selecionar White/black
Selecionar a ferramenta lápis
Clicar duas vezes no ícone para abrir o editor de espessura >
Na aba Pencil tool > Pencil width (pixels) = 3 > OK
Utilizando a imagem duplicada como guia, separar as células da imagem binária manualmente com a ferramenta lápis.
Para medir as células:
Menu Analyze > Analyze Particles
Na aba Analyze Particles > Size (micron^2) = 10-Infinity > √ Summarize > √ Display results > OK
Na aba Process stack? > Process all images? > Yes
Duas tabelas contendo o resumo de cada imagem do stack e os resultados de cada célula serão criados pelo sistema e podem ser salvos como arquivo de texto .csv.
Menu File > Save as > Selecionar a pasta > Save
A área das células estará disposta em µm2 e a circularidade celular estará disposto em índice (0 mais alongado > 1 mais circular). Os arquivos de texto podem ser compilados no Excel para organização dos dados e análise estatística.
Processamento de Imagens: Imagens Representativas
Abrir o software FIJI
Software
ImageJ/Fiji
NAME
Windows 7
OS
National Institutes of Health
DEVELOPER
SOURCE LINK
Arrastar o arquivo bruto em formato .HTD para o FIJI. Elas devem ser importadas através do BioFormats conforme a imagem abaixo:
Todas as imagens da placa adquirida irão ser importados de uma única vez. Caso a placa seja muito pesada, você pode selecionar sítio por sitio, realizando uma importação a cada vez.
A escala das imagens já deverá estar ajustada. Caso contrário, efetuar o ajuste da escala das imagens:
Menu Analyze > Set scale >
Para 4x: 500 px = 800 µm
Para 10x: 600 px = 400 µm
Para 20x: 600 px = 200 µm
Para 40x: 600 px = 100 µm
Para 60x: 480 px = 50 µm
>
Para separar os filtros:
Menu Image > Colors > Split channels
Teremos DAPI = C1, FITC = C2 e Cy5 = C3
Para colorir as imagens:
Selecionar o filtro desejado
Menu Image > Lookup tables > Selecionar a cor desejada
Para selecionar uma região na imagem:
Com a ferramenta retângulo, selecionar um quadrado (dica: verificar o valor das arestas na barra do FIJI).
Menu Image > Duplicate
Na aba Duplicate > √ Duplicate Stack > OK
Para levar essa seleção à outra imagem, mantendo seu tamanho e coordenada:
Menu Edit > Selection > Restore Selection
Menu Image > Duplicate
Na aba Duplicate > √ Duplicate Stack > OK
Para criar uma imagem multicolorida (OBS: Imagens precisam ter mesmo tamanho e profundidade):
Menu Image > Colors > Merge channels
Na aba Merge channels > Incluir as imagens nos filtros > √ Create composite > √ Keep source images > OK
Para adicionar uma barra de escala:
Menu Analyze > Tools > Scale Bar
Aba Scale Bar > Selecionar tamanho da barra (Width) e espessura (Thickness in pixels) > Ajustar tamanho do texto e/ou retirar o texto da barra > OK
Para salvar as imagens:
Menu File > Save as > PNG... > Selecionar a pasta de destino > OK
Protocol references
PACHANE, Bianca Cruz et al. Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Triple-Negative Breast Cancer Cells Induce Oxygen-Dependent Cell Invasion. International Journal of Molecular Sciences, [s. l.], v. 23, n. 20, p. 12646, 2022.
EVEN-RAM, Sharona; ARTYM, Vira. Extracellular Matrix Protocols: Second Edition. [S. l.]: Humana Press, 2009.