Fast Track - Nanopore - SSI

Theis Hass THTR Thorsen; Sekventeringsenheden SB

Feb 03, 2025

Fast Track - Nanopore - SSI

DOI

dx.doi.org/10.17504/protocols.io.e6nvwd3n2lmk/v1

¹Department of Sequencing and Bioinformatics

SSI - SB - Sequencing Core Facility
Tech. support email: Sekventeringsenheden@ssi.dk

Sekventeringsenheden SB

Sequencing and Bioinformatics

DOI: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.e6nvwd3n2lmk/v1

Protocol Citation: Theis Hass THTR Thorsen, Sekventeringsenheden SB 2025. Fast Track - Nanopore - SSI. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.e6nvwd3n2lmk/v1

License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited

Protocol status: Working

We use this protocol and it's working

Created: February 20, 2024

Last Modified: February 03, 2025

Protocol Integer ID: 95462

Keywords: Statens Serum Institut, SSI, Sequencing Core Facility , Sekventeringsenheden, Fast Track, Sekventering , Sequencing, Isolates, Bacterial isolates, DNA sequencing, DNA, MagLEAD, Nanopore, Oxford Nanopore Technologies, GridION, Rapid Barcoding Kit 96 V14, SQK-RBK114.96

Funders Acknowledgements:

European Health and Digital Executive Agency (HaDEA)

Grant ID: 101111879

Disclaimer

This method was not developed from scratch at Statens Serum Institut. It is a method composed of methods from Precision System Science (DNA isolation and clean up) and Oxford Nanopore Technologies (Library preparation and sequencing). See under Protocol References for links to the original protocols.

Abstract

Protocol for the 'fast track' sequencing flow at the Sequencing Core Facility at Statens Serum Institut (SSI). This method utilises the MagLEAD system for DNA extraction and cleaning followed by the Nanopore sequencing platform for library prep. (Kit: SQK-RBK114-96) and sequencing (GridION w. flow cell type: FLO-MIN114). Both isolates and cleaned up DNA can be used as input material. 
Note, this protocol is in Danish.

Image Attribution

Statens Serum Institut, www.ssi.dk. 

Guidelines

Handler det om modtagelse af flow celler - gå til sektionen: Modtagelse af flowceller (trin 1).
Hvis input materialet er lysater - gå til sektionen: MagLEAD oprensning (trin 6).
Hvis input materialet er DNA - gå til sektionen: Nanopore "library prep." (trin 46).

Materials

Instrumenter:
- Køl/Frys
- Vortex
- Centrifuge (1,5 mL rør, PCR rør/plader)
- Qubit 4 Fluorometer (Invitrogen - Thermo Fisher Scientific (TFS)) 
- PCR-maskine
- Thermomixer C (Eppendorf)
- Hulamixer sample mixer (TFS)
- magLEAD (Precision System Science (PSS))
- GridION (Oxford Nanopore Technologies (ONT))

Redskaber:
- Pipetter - p10, p100, p1000
- Magnetholder (1,5 mL rør)
- Køleblok (1,5 mL rør)

Forbrugsvarer:
- Flowceller R10.4.1 (ONT)
- "Micro-tube" rør ("magLEAD Consumable Kit" REF: F4430 - PSS)
- "Tip and sheath set" ("magLEAD Consumable Kit" REF: F4430 - PSS)
- 1,5 mL "Lo-bind" rør
- 96-brønds "Lo-bind" PCR-plader
- 8-rør "thin-walled" PCR-strimmel
- Qubit rør (#Q32856, Invitrogen - TFS)
- "Wide bore" pipettespidser - (p10, p100, p1000)
- "Seals"
- Handsker (gerne med høj gennembrudstid)
- Is

Protocol materials

ReagentMagDEA Dx SVPrecision System Science co. ltdCatalog #E1300 
ReagentMagDEA Dx SVPrecision System Science co. ltdCatalog #E1300 
ReagentEtOH 
ReagentNuclease-free Water 
ReagentQubit™ dsDNA BR Assay KitThermo Fisher ScientificCatalog #Q32853 
ReagentMagDEA Dx SVPrecision System Science co. ltdCatalog #E1300 
ReagentMagDEA Dx SVPrecision System Science co. ltdCatalog #E1300 
ReagentRapid Barcodes (RB01-96)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentRapid Barcodes (RB01-96)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentAMPure XP Beads (AXP) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentEtOH 
ReagentEtOH 
ReagentRapid Adapter (RA)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentLibrary Beads (LIB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentFlow Cell Tether (FCT)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentBovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/mL)Fischer ScientificCatalog #AM2616 
ReagentSequencing Buffer (SB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentFlow Cell Flush (FCF)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentFlow Cell Tether (FCT)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentBovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/mL)Fischer ScientificCatalog #AM2616 
ReagentSequencing Buffer (SB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentLibrary Beads (LIB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentQubit™ dsDNA BR Assay KitThermo Fisher ScientificCatalog #Q32853 
ReagentAdapter Buffer (ADB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentRapid Adapter (RA)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentEtOH 
ReagentNuclease-free Water 
ReagentQubit™ dsDNA BR Assay KitThermo Fisher ScientificCatalog #Q32853 
ReagentAMPure XP Beads (AXP) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentAMPure XP Beads (AXP) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentNuclease-free Water 
ReagentFlow Cell Flush (FCF)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentNuclease-free Water 
ReagentEtOH 
ReagentQubit™ dsDNA BR Assay KitThermo Fisher ScientificCatalog #Q32853 
ReagentNuclease-free Water 
ReagentEtOH 
ReagentAMPure XP Beads (AXP) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentElution Buffer (EB) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentAMPure XP Beads (AXP) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 
ReagentElution Buffer (EB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 

Safety warnings

ReagentMagDEA Dx SVPrecision System Science co. ltdCatalog #E1300  er mærket med følgende faremærker:

Sundhedsfare

Brandfarlig

Miljøfare

Kronisk sundhedsfare

Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og "tykke" handsker).

Before start

Handler det om modtagelse af flow celler - gå til sektionen: Modtagelse af flowceller (trin 1).
Hvis input materialet er lysater - gå til sektionen: MagLEAD oprensning (trin 6).
Hvis input materialet er DNA - gå til sektionen: Nanopore "library prep." (trin 46).

Hvis input materialet er DNA, start med at bestemme koncentrationen i prøverne.

Modtagelse af flowceller

Tag alle pakkerne med flowceller R10.4.1 (FLO-MIN114, Oxford Nanopore Technologies (ONT), Oxford, Storbritannien) ud af kassen som de er ankommet i.

Læg dem i rum 126 - Amplicon og lad dem opnå stuetemperatur.

Lav et "flow cell check" på alle flowcellerne.     

Note
Flowceller R10.4.1 er dækket af en købsgaranti på +800 aktive pore. 
Hvilket betyder, at hvis der er under 800 aktive pore på en flowcelle ved første "flow cell check", kan den/de sendes tilbage, og nye vil blive fremsendt kvit og frit.
Vigtigt: flowceller med under 800 aktive porer skal fejlmeldes til Nanopore inden for 2 dage efter første "flow cell check" for at få den/dem refunderet.

Notér datoen for modtagelse af flowcellerne, antal aktive pore ("pore count") samt "flow cell id" på deres indpakning (se billede 1 nedenfor).

Billede 1: Flowcelle (til højre) af typen R10.4.1 med "flow cell id", samt indpakningen (til venstre) med "flow cell id", "pore count" og dato.

Put flowcellerne tilbage i deres indpakning og læg dem på køl (opb. på køl i rum 126 - Amplicon).

MagLEAD oprensning

Hent indleverede lysater i fryseren (SSI nr.: 810978) i rum 134 (Hamilton 1).

Lad dem tø ved stuetemperatur. 

Find følgende komponenter frem:

Forbrugsvarer 
"Micro-tube" rør 
      - findes i "magLEAD Consumable Kit" (REF: F4430, Precision System Science co. ltd. (PSS), Chiba,
        Japan) i rum 119.
"Tip and sheath set"
      - findes i "magLEAD Consumable Kit" (REF: F4430, PSS).
Reagenser
ReagentMagDEA Dx SVPrecision System Science co. ltdCatalog #E1300  
      - findes i ”Magtration Reagent / MagDEA Dx SV” kassen (REF: E1300, PSS) i rum 119.

Safety information
ReagentMagDEA Dx SVPrecision System Science co. ltdCatalog #E1300  er mærket med følgende faremærker:

Sundhedsfare

Brandfarlig

Miljøfare

Kronisk sundhedsfare

Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og "tykke" handsker).

Overfør Amount250 µL   fra hver lysat til nye 1,5 mL "micro-tube" rør.

Tag stativet til rør og spidser (se billede 2 nedenfor)

Billede 2: Stativ til rør og spidser.
ud af 
Equipment
magLEAD
NAME
12gC
TYPE
Precision System Science co. ltd
BRAND
8.11.06
SKU
https://bioservices.se/en/dna-rna-extraction/extraction-instrument/pss-maglead-12gc-2/
LINK

Placér "micro-tube" rørene med lysat i stativet i rækken markeret med "S" ("Sample").

Find det samme antal "tip and sheath set" og placér dem i række "T1" ("Tip 1") i stativet.

Placér nye "micro-tube" rør i række "E" ("Elution") i stativet.

Tag stativet til reagenser (se billede 3 nedenfor) ud af magLEAD'en.

Billede 3: Stativ til reagenser.

Find et antal ReagentMagDEA Dx SVPrecision System Science co. ltdCatalog #E1300  svarende til antallet af lysater og placér dem i stativet til reagenser, startende fra venstre.

Sæt stativet med reagenser (Billede 3) tilbage på sin plads i magLEAD'en.

Sæt stativet med rør og spidser (Billede 2) tilbage på sin plads i magLEAD'en.

Tænd magLEAD'en og lad den initialisere.

På displayet til venstre på instrumentet, tryk på Start. 
(Instrumentet initialiserer igen).

Tryk på Enter (nedadgående pil der drejer til venstre). 
(Godkender at initialiseringen er gået fint, og instrumentet kan fortsætte).

Ønskes der at skrive batch info for kørslen ind, tryk på Enter.
Ellers tryk på Start.

Tryk på Enter.
(Godkender den foreslåede type af "reagent cartridge").

Tryk på Enter.
(Stativerne til reagenser og rør og spidser er allerede blevet sat på plads i instrumentet).

Tryk på 2.
(Valg af elueringsvolumen - i denne protokol skal den sættes til Amount100 µL  ). 

Tryk på Enter.
(Godkender de foreslåede voluminer for "sample" og "elution").

Tryk på Start.
Herved startes kørslen. Kørslen tager ca. Duration00:30:00   uafhængigt af antallet af prøver (1-12 stk.).

30m

Når kørslen er færdig:

Tag eluaterne (de oprensede prøver - står i række "E") ud af instrumentet og sæt dem på is.

Samle de resterende ting (reagenser, rør og spidser) omhyggeligt i en plastpose og bortskaf det hele som affaldsgruppe X (hvid spand i stinkskab SSI nr.: 810309 i rum 122).

UV-dekontaminering på magLEAD

30m

Efter endt oprensning, eller når instrumentet tændes, er det muligt at køre en UV-dekontaminering på instrumentet, hvilket gøres på følgende måde: 

Skal der køres UV inden en kørsel - Tænd for instrumentet.
Skal der køres UV efter en kørsel - Følg instrukserne på skærmen indtil startmenuen er nået.

Tryk på 1.
(UV-program).

UV-dekontaminering på magLEAD

30m

Indtast antal minutter UV-programmet skal køre.
(Standard er Duration00:30:00  ).

30m

UV-dekontaminering på magLEAD

30m

Tryk på Enter.
(Godkender kørselstiden på UV-programmet).

Tryk på Start.
(Herved startes UV-programmet).

Sekundær oprensning af DNA-produkt

Note
Fra dette punkt foregår arbejdet manuelt.

Find følgende komponenter frem: 
ReagentAMPure XP Beads (AXP) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  (opbevares på -20°C i rum 126 - Amplicon) - temperér ved stuetemp. og vortex for at re-suspendere "beads".
ReagentEtOH  Concentration80 % (v/v) Friskblandet  - 200 μL pr. prøve + 100 μL.
ReagentNuclease-free Water  - ved stuetemperatur eller ved 55 °C.
ReagentQubit™ dsDNA BR Assay KitThermo Fisher ScientificCatalog #Q32853  (opbevares på køl i rum 126 - Amplicon).

Overfør Amount50 µL   DNA-produkt fra hver "micro-tube" rør til nye 1,5 mL "LoBind" rør. 

Tilsæt Amount50 µL   ReagentAMPure XP Beads (AXP) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  til rørene (sæt efterfølgende "beads" på is). 

Mix og spin rørene kort. 

Inkubér rørene i Duration00:05:00 stuetemperatur .

Sæt rørene i en magnetholder og inkubér yderligere Duration00:05:00  , indtil alle "beads" er samlet på indersiden af røret ind mod magneten. 

Fjern og kassér supernatanten med en p100 pipette.

Vask "beads" 2 gange på følgende måde:

Lad rørene blive på magneten og tilsæt Amount100 µL   frisk Concentration80 % (v/v)   ReagentEtOH  til hvert rør.

Vent Duration00:00:30  .

30s

Fjern og kassér supernatanten.
(Efter 1. vask Go togo to step #35.1  )

Fjern omhyggeligt alle rester af ethanol med en p10 pipette. 

Lad rørene tørre i Duration00:00:30  , men undgå at ”pellet” tørrer ud.

30s

Tilsæt Amount50 µL   ReagentNuclease-free Water  (stuetemperatur/55°C) til rørene og opløs pellet ved forsigtigt at resuspendere prøverne med en p100 pipette. 

Mix og spin ned.

Inkubér rørene i Duration00:05:00 stuetemperatur .

"Pellet” prøverne på magnetholderen i ~Duration00:05:00   indtil eluatet er klart og uden farve.

Udtag herefter Amount45 µL   eluat til nye 1,5 mL "LoBind" rør.

Bestem DNA koncentrationen i prøverne på en
Equipment
Qubit 4
NAME
Fluorometer
TYPE
Invitrogen
BRAND
Q33238
SKU
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
LINK
med ReagentQubit™ dsDNA BR Assay KitThermo Fisher ScientificCatalog #Q32853  (Mål på Amount2 µL  ).

Note
Hvordan man måler på Qubit (Amount2 µL   prøve)
Tag et antal Qubit-rør (#Q32856, Invitrogen - Thermo Fisher) frem matchende antallet af prøver + 2 mere til standarder.
Pipettér følgende volumener af "working solution" til de to typer af rør: Amount198 µL   til alle prøverør samt Amount190 µL   til de to rør til standarder.
Tilføj Amount10 µL   af hhv. standard #1 og #2 til hvert sit rør til standarderne med "working solution" (den totale volumen skal være 200µL).
Tilføj Amount2 µL   fra hver prøve til hvert sit prøverør med "working solution" (den totale volumen skal være 200µL).
Vortex alle rør og inkubér dem i Duration00:02:00   ved stuetemperatur. Tjek at der ikke er nogle bobler i væsken.
Fra forsiden på instrumentet vælg dsDNA og derefter 1x  dsDNA Broad Range.
Vælg Read Standards og følg anvisningerne. 
Efter begge standarder er målt, vælg Run samples og sørg for at "original sample volume" er sat til 2µL, samt at "output sample units" er sat til ng/µL. 
Sæt den første prøve i instrumentet og vælg Read tube. Notér koncentrationen. 
Forsæt med de resterende prøver.

Skriv koncentrationerne ind i det klargjorde sample sheet (FT_WGS_xx - xx er kørselsnummeret) på den første fane Sample_sheet i kolonnen ConcentrationOfExtraction_ng_per_ul.

Hvis prøverne ikke skal bruges med det samme - Sæt prøverørene på -20 °C. 
Hvis prøverne skal bruges med det samme - Gå videre til næste trin.

Nanopore "library prep."

54m

Find følgende komponenter frem: 

ReagentNuclease-free Water  
ReagentEtOH Amount1.2 mL  Concentration80 % (v/v) Friskblandet                                                                                       - Amount1000 µL  Concentration99.9 % (v/v)  ReagentEtOH  + Amount237 µL  ReagentNuclease-free Water 
ReagentQubit™ dsDNA BR Assay KitThermo Fisher ScientificCatalog #Q32853  (opb. på køl).
ReagentAMPure XP Beads (AXP) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96               (opb. på -20°C i rum 126 - Amplicon, eller er taget frem tidligere).
ReagentElution Buffer (EB) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96                         (opb. på -20°C i rum 126 - Amplicon).
ReagentFlow Cell Flush (FCF)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96                     (opb. på -20°C i rum 126 - Amplicon).
Flowcelle R10.4.1 (FLO-MIN114, Oxford Nanopore Technologies, Oxford, Storbritannien)                    (opb. på køl i rum 126 - Amplicon).

Lad komponenterne tø/temperere ved stuetemperatur.
Når reagenserne fra frys er tøet op, stil dem på is.

Note
Er det lang tid siden at flowcellerne blev modtaget, er det en god idé at lave et ekstra "flow cell check", for at se om de stadig har nok pore.

Tænd for
Equipment
Thermomixer C
NAME
5382
TYPE
Eppendorf 
BRAND
5382000015
SKU
https://www.eppendorf.com/dk-en/Products/Temperature-Control-and-Mixing/Instruments/Eppendorf-ThermoMixerC-p-PF-19703
LINK
Sæt Shaker0 rpm, 56°C  og start instrumentet (giver instrumentet lov til at varme op til 56 °C).

Fortynd hver enkel prøve til Concentration400 Mass Percent   genomisk DNA i Amount20 µL   som angivet i FT_WGS_xx, i den anden fane Dilution sheet, kolonne I + J.
(Hvis prøven har en for lav koncentration fortsættes med Amount20 µL   ufortyndet prøve).

(Fortynd prøverne i 0,2 mL "thin-walled" PCR rør eller en 96-brønds "LoBind" PCR-plade). 

Bland hver enkel prøve ved forsigtigt at pipettere op og ned 10-15 gange.

Spin kortvarigt prøverne ned.

Find ReagentRapid Barcodes (RB01-96)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  frem fra frys (opbevares på -20°C i rum 126 - Amplicon) og sæt dem i en køleblok. 

! Det er vigtigt at Rapid Barcodes (RB01-96) hele tiden holdes på en køleblok, imens de er uden
for fryseren. Så snart de er brugt, skal de åbne brønde tapes til og sættes tilbage på frys !

Tilsæt Amount3 µL   (pr. 400 ng prøve) ReagentRapid Barcodes (RB01-96)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  til hver prøve som angivet i FT_WGS_xx, i den anden fane Dilution sheet, kolonne E, F og K.

Bland hver enkel prøve ved forsigtigt at pipettere op og ned et par gange og spin dem ned.

Inkubér prøverne ved: 
Temp.Tid
30 ℃00:02:00
80 ℃00:02:00
10 ℃∞
Varmeprogram

Put prøverne kortvarigt på en køleblok for at blive kølet ned.

"Pool" alle de ’barkodede’ prøver (Amount23 µL   pr. prøve) i et nyt 1,5 mL "LoBind" rør, og notér den totale volumen i røret (gang 23 μL med antallet af prøver).

Re-suspendér ReagentAMPure XP Beads (AXP) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  ved at vortexe røret.

Tilsæt ReagentAMPure XP Beads (AXP) Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  i forholdet 1:0,5 (prøvevolumen:"beads") til røret med de pooled prøver. 

Bland prøven ved at ”flicke”/flippe røret.

Inkubér prøven i Duration00:10:00 stuetemperatur  på en 
Equipment
Hulamixer sample mixer
NAME
V.3A01
TYPE
Invitrogen 
BRAND
15920D
SKU
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15920D
LINK

10m

Spin prøven ned og "pellet” den på en magnetholder i ~Duration00:04:00   indtil prøven er klar og uden farve.

Hold røret på magnetholderen og pipettér supernatanten fra.

Tilsæt Amount600 µL   Concentration80 % (v/v) friskblandet  ReagentEtOH  uden at forstyrre ”pellet”. 

Fjern ethanolen efter Duration00:00:30   med en pipette.

30s

Tilsæt igen Amount600 µL   Concentration80 % (v/v) friskblandet  ReagentEtOH  uden at forstyrre ”pellet”.

Fjern ethanolen efter Duration00:00:30   med en pipette.

30s

Spin kortvarigt prøven ned og sæt røret tilbage på magnetholderen.

Efter Duration00:00:30  , fjern resterne af ethanol med en pipette.

30s

Lad prøven tørre i Duration00:00:30  , men undgå at ”pellet” tørrer ud.

30s

Fjern røret fra magnetholderen og re-suspendér prøven i Amount15 µL   (pr. 24 prøver) ReagentElution Buffer (EB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96 .

Inkubér prøven ved Shaker0 rpm, 56°C, 00:10:00  på
Equipment
Thermomixer C
NAME
5382
TYPE
Eppendorf 
BRAND
5382000015
SKU
https://www.eppendorf.com/dk-en/Products/Temperature-Control-and-Mixing/Instruments/Eppendorf-ThermoMixerC-p-PF-19703
LINK
I løbet af inkubationstiden, tag prøven op og "flick" den hvert Duration00:02:00  .

12m

Find følgende komponenter frem: 
ReagentBovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/mL)Fischer ScientificCatalog #AM2616  
ReagentSequencing Buffer (SB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  
ReagentLibrary Beads (LIB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  
ReagentFlow Cell Tether (FCT)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  
     (alle ovenstående komponenter opb. på -20°C i rum 126 - Amplicon).

Lad dem tø ved stuetemperatur, mix og spind ned.

"Pellet” prøven på magnetholderen i ~Duration00:01:00   indtil eluatet er klart og uden farve.

Bestem DNA koncentrationen i prøven på et
Equipment
Qubit 4
NAME
Fluorometer
TYPE
Invitrogen
BRAND
Q33238
SKU
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
LINK
med et ReagentQubit™ dsDNA BR Assay KitThermo Fisher ScientificCatalog #Q32853  (Mål på Amount1 µL  ).

Note
Hvordan man måler på Qubit (Amount1 µL   prøve)
Tag et antal Qubit-rør (#Q32856, Invitrogen - Thermo Fisher) frem matchende antallet af prøver + 2 mere til standarder.
Pipettér følgende volumener af "working solution" til de to typer af rør: Amount199 µL   til alle prøverør samt Amount190 µL   til de to rør til standarder.
Tilføj Amount10 µL   af hhv. standard #1 og #2 til hvert sit rør til standarderne med "working solution" (den totale volumen skal være 200µL).
Tilføj Amount1 µL   fra hver prøve til hvert sit prøverør med "working solution" (den totale volumen skal være 200µL).
Vortex alle rør og inkubér dem i Duration00:02:00   ved stuetemperatur. Tjek at der ikke er nogle bobler i væsken.
Fra forsiden på instrumentet vælg dsDNA og derefter 1x  dsDNA Broad Range.
Vælg Read Standards og følg anvisningerne. 
Efter begge standarder er målt, vælg Run samples og sørg for at "original sample volume" er sat til 1µL, samt at "output sample units" er sat til ng/µL. 
Sæt den første prøve i instrumentet og vælg Read tube. Notér koncentrationen. 
Forsæt med de resterende prøver.

Overfør Concentration2000 ng   DNA prøve af eluatet til et nyt 1,5 mL DNA "LoBind" rør og tilføj ReagentNuclease-free Water  til en endelig volumen på Amount11 µL  . 
Hvis der ikke er nok DNA i prøven overføres bare Amount11 µL   af eluatet.

Note
Beregning på hvor meget af eluatet der skal overføres

Bland følgende i et nyt 1,5 mL DNA "LoBind" rør:
Amount3.5 µL   ReagentAdapter Buffer (ADB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  (opb. på -20°C i rum 126 - Amplicon).
Amount1.5 µL   ReagentRapid Adapter (RA)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96     (opb. på -20°C i rum 126 - Amplicon).
       Stil dette reagens på frys igen så snart det er brugt.

Bland ved pipettering.

Tilføj Amount1 µL   fortyndet ReagentRapid Adapter (RA)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  til de 11 uL prøve med ’barkodede’ DNA.

Bland ved forsigtigt at ”flicke”/flippe røret og spin det ned.

Inkubér prøven i Duration00:05:00 stuetemperatur  (10 minutter hvis reaktionen er viskøs).

Sæt efterfølgende prøven på is / en køleblok.

Bland følgende komponenter for at forberede ”flow cell priming mix” med BSA:
Amount1170 µL   ReagentFlow Cell Flush (FCF)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  
Amount30 µL   ReagentFlow Cell Tether (FCT)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  
Amount5 µL   ReagentBovine Serum Albumin (BSA) (50 mg/mL)Fischer ScientificCatalog #AM2616  

Vend røret nogle gange for at blande det.

Hent flowcellen (R10.4.1), tag plastkassen ud af indpakningen og tag låget af kassen. 
Lad flowcellen sidde i kassen for at give mere stabilitet.

Billede 4: Nanopore flowcelle i en MinION holder.

Skub ”flow cell priming port cover” (se billede 4 ovenfor) med uret 90⁰ for at åbne til ”priming port”.

Efter at der er åbnet til ”priming port”, tjek da for små luftbobler under låget. 
Træk herefter en lille volumen ud, for at fjerne potentielle luftbobler, på følgende måde:

Sæt en p1000 pipette til Amount200 µL  .

Sæt en pipettespids på pipetten og sæt pipettespidsen lodret i ”priming port”.

Drej hjulet på pipetten "op" (øg volumen) indtil en lille smule buffer (er gul) kommer op i pipettespidsen.

! Det er vigtigt at der under dette stadig er buffer hele vejen fra ”priming port” hen over ”sensor array” (se billede 4). Hvis der introduceres luftbobler ind til ”sensor array”, kan det ødelægge porerne i flowcellen !

Fjern pipetten og smid pipettespidsen ud.

Pipettér Amount800 µL   ”priming mix” til flowcellen via. ”priming port" på følgende måde:

Undgå at introducere luftbobler ved at pipettere en lille dråbe på flowcellen ved side af ”priming port” for efterfølgende at ”skubbe” pipettespidsen sammen med dråben hen i ”priming port”.

Pipettér Amount800 µL   ”priming mix” til flowcellen. 

Stop lige inden at pipettespidsen er helt tømt, fjern pipetten og smid pipettespidsen ud.

Inkubér flowcellen i Duration00:05:00 stuetemperatur .

Imens kan biblioteket gøres klar til sekventering. 

Tilsæt følgende til røret med DNA-biblioteket (prøven):
Amount37.5 µL   ReagentSequencing Buffer (SB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  
Amount25.5 µL   ReagentLibrary Beads (LIB)Oxford Nanopore TechnologiesCatalog #SQK-RBK114.96  
     Mix røret med "beads" lige inden der overføres.

Åben forsigtigt ”SpotON port cover” (se billede 4) på flowcellen for at åbne ”SpotON sample port”.

Pipettér Amount200 µL   ”priming mix” til flowcellen via. ”priming port” (ikke ”SpotON sample port”). 
Undgå at introducere luftbobler (se trin 84.1).

Bland det forberedte bibliotek (prøven) ved forsigtigt at pipettere prøven op og ned med en pipette lige inden det skal overføres til flowcellen.

Overfør Amount75 µL   prøve til flowcellen via. ”SpotON sample port” én dråbe ad gangen. 

Hvordan:
Hold pipetten lodret ~1 cm over ”SpotON sample port” og lad én dråbe ad gangen falde ned på ”bakken” til ”SpotON sample port”. Sørg for at dråben er trukket ned igennem porten før den næste tilføjes.

Luk forsigtigt ”SpotON port cover” og sikre at den er lukket ordentligt.

Luk for ”priming port”.

Læg herefter det sorte "cover" over "sensor array" på flowcellen (se billede 5) for at beskytte det mod lys.

Billede 5: A: Sort "cover". B: Sort "cover" der dækker "sensor array" på en flowcelle.

Placér flowcellen i en ledig position (se billede 6) på 
Equipment
GridION
NAME
X5 - GRD-X5B003
TYPE
Oxford Nanopore Tech.
BRAND
GRD-MK1
SKU
https://store.nanoporetech.com/eu/gridion.html
LINK
og lad herefter flowcellen henstå i Duration00:15:00   inden sekventeringen påbegyndes.


Billede 6: Flowcelle placeret i position X2 på en GridION.

15m

Opsætning på GridION

Åben software MinKNOW.

Vælg Start i øverste venstre hjørne.

Vælg Start sequencing (se billede 7).

Billede 7: Opsætning af et run i MinKNOW.

Skriv kørsels ID'et (FT_WGS_xx) ind under ”Experiment name” og ”Sample ID” (se billede 8).

Billede 8: Opsætning af et run i MinKNOW.

Under ”Device positions” vælg type samt de positioner hvor der er installeret en eller flere flowceller.

Tryk på Continue (nedre højre hjørne).

Markér DNA, PCR-free og Yes øverst på skærmen (se billede 9).

Billede 9: Opsætning af et run i MinKNOW.

Vælg herefter Rapid Barcoding Kit 96.

Tryk på Continue (nedre højre hjørne).

Under ”Basecalling” (se billede 10), tryk på det grå ikon til højre og vælg Super-accurate basecalling i drop-down menuen under "Basecalling model".

Billede 10: Opsætning af et run i MinKNOW.

Under “Barcoding”, tryk på det grå ikon til højre og vælg Trim barcodes til.

Under “File output options” (se billede 11), tryk på det grå ikon til højre og vælg FAST5 under "Raw reads output".

Billede 11: Opsætning af et run i MinKNOW.

Under “Filtering”, tryk på det grå ikon til højre og sæt:
"Min. read length" til at være 200 b
"Min. Q score" til at være 12

Gennemgå at alt er som det skal være.

Tryk på Start (nedre højre hjørne).

Efter kørslen er sat i gang

Tilføj følgende informationer på den første fane Sample_sheet i sample sheet arket (FT_WGS_xx):

Tilføj ”flow_cell_id” i kolonnen flow_cell_id (kolonne M).

Tilføj ”kit” type i kolonnen kit (kolonne N).

Tilføj ”flow_cell_product_code” i kolonnen flow_cell_product_code (kolonne T).

Tilføj plade ID / MagLEAD dato i kolonnen PlateName (kolonne V).

Tilføj nanopore barkoder / brøndposition i kolonnen WellPositionInDNAPlate (kolonne W).

Tilføj dato for hvornår prøverne (nanopore prøver) oprenses i kolonnen BatchRunDate (kolonne Z).

Tilføj dato for hvornår prøverne/biblioteket sekventeres i kolonnen SequenceRunDate (kolonne AA).

Protocol references

DNA-oprensningen er baseret på protokollen "magLEAD 12gC User Manual" version 1.3 af Precision System Science:
https://www.pssbio.com/wp-content/uploads/2021/09/12gC-Manual.pdf 

Klargøring af bibliotek og opsætning af sekventering er baseret på protokollen "Rapid sequencing DNA V14 - barcoding (SQK-RBK114.24 or SQK-RBK114.96)" fra Oxford Nanopore Technologies:
https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/rapid-sequencing-gdna-barcoding-sqk-rbk114/v/rbk_9176_v114_revm_27nov2022?devices=gridion 

Acknowledgements

This activity is supported by co-funding from the European Union’s EU4Health programme under Grant Agreement Nr 101111879 SSI-Seq and Statens Serum Institut (SSI).

	Temp.	Tid
	30 ℃	00:02:00
	80 ℃	00:02:00
	10 ℃	∞

Public workspaceFast Track - Nanopore - SSI

Fast Track - Nanopore - SSI