Sep 06, 2025

Expressão e purificação de transcriptase reversa MMLV

This  protocol  is a draft, published without a DOI.
  • 1Universidade Federal de Viçosa
Leandro L Oliveira
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Protocol Citation: Daniel Silva Sena Bastos, Israr Ali Khan, Leandro L Oliveira 2025. Expressão e purificação de transcriptase reversa MMLV. protocols.io https://dx.doi.org/
License: This is an open access  protocol  distributed under the terms of the  Creative Commons Attribution License,  which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
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Created: September 06, 2025
Last Modified: September 06, 2025
Protocol  Integer ID: 226642
Keywords: M-MuLV RT, MMLV RT, Moloney Murine Leukemia Virus, rna para direcionar, transcriptase, rna, produzindo dna complementar, vírus da leucemia murina, por meio da transcrição reversa
Funders Acknowledgements:
FAPEMIG
Grant ID: BPD-00294-22
CNPq
Grant ID: 150438/2023-0
Abstract
A Transcriptase Reversa do Vírus da Leucemia Murina de Moloney (RT-MMLV) é uma DNA polimerase dependente de RNA. Essa enzima pode sintetizar uma fita complementar de DNA a partir de um molde de RNA, por meio da transcrição reversa, produzindo DNA complementar (cDNA). As transcriptases reversas (RTs) utilizam um molde de RNA e um primer curto complementar à extremidade 3' do RNA para direcionar a síntese da primeira fita de cDNA, que pode ser usada diretamente como molde para aplicações como PCR, qPCR, LAMP ou sequenciamento.
Materials
Tampão de Ligação
50 millimolar (mM) Tris-HCl, pH 8,0
150 millimolar (mM) NaCl
40 millimolar (mM) Imidazol

Tampão de Eluição
50 millimolar (mM) Tris-HCl, pH 8,0
150 millimolar (mM) NaCl
300 millimolar (mM) Imidazol


Transformação de células competentes
1d
Descongele uma alíquota50 µL de células competentes C41(DE3) On ice

Pipete 100 ng do plasmídeo contendo o gene RT-MMLV na alíquota e deixe o tubo descansar no gelo por 00:30:00

30m
Incube o tubo a 42 °C por 00:00:45

45s
Rapidamente retorne o tubo para o gelo por 00:05:00

5m
Adicione ao tubo 500 µL de meio LB ou SOC e incube a 37 °C por 01:00:00

1h
Centrifugue o tubo 4500 rpm, Room temperature, 00:05:00

5m
Descarte o sobrenadante e plaqueie as células em uma placa de ágar LB previamente suplementada com Ampicilina100 µg/mL

Incube a placa Overnight a 37 °C

Preparação do pré-inóculo
1d
Selecione uma colônia bacteriana isolada da placa e inocule em um tubo falcon com 5 mL de meio LB acrescido de ampicilina 100 µg/mL . Incubar o tubo Overnight sob agitação 220 rpm, 37°C

Expressão da proteina
1d
Inocular 200 µL do pré-inóculo em um frasco Erlenmeyer com 200 mL de meio LB acrescido de ampicilina 100 µg/mL . Incubar a 220 rpm, 37°C até OD600 = 0,6-0,8 (4-5 horas).

adicionar IPTG a uma concentração final de0,4 millimolar (mM) e incubar a220 rpm, 18°C, 16:00:00

Centrifugar a cultura de células 5000 rpm, 4°C, 00:10:00 . Descartar o sobrenadante. Neste ponto, você pode armazenar o pelete de células a -20°C até que esteja pronto para executar a purificação.

5m
Purificação da proteína
2h 38m
Ressuspender o pelete de células em 20 mL de tampão de ligação e sonicar 00:08:00 (pulso 1 sec on 4 sec off) no gelo.

8m
centrifugar a 8000 x g, 4°C, 00:10:00 . Colete o sobrenadante e identifique-o como fração solúvel. O pellet representa a fração insolúvel. Colete pequenas frações de cada uma para fazer um SDS-PAGE.

10m
Preparar a coluna HisTrap de 1 mL no sistema FPLC. Lavar o sistema e equilibrar a coluna com 7 volumes de coluna (c.v.) de tampão de ligação.
20m
Aplicar a amostra (fração solúvel) a um fluxo de 1 mL/min. Lave a coluna com 15 c.v. de tampão de ligação, até que o sinal de UV e condutividade se estabilize. Em seguida, elua a proteína ligada com 10 c.v. de tampão de eluição.

1h
Determinar as frações com o RT-MMLV, unir e dializar as frações eluídas. Adicionar glicerol a 50%, homogeneizar, fazer alíquotas de 400 µL , armazená-las a -20 °C.

1h