Sep 06, 2025

Public workspaceExpressão e purificação de transcriptase reversa MMLV

This protocol is a draft, published without a DOI.
  • Daniel Silva Sena Bastos1,
  • Israr Ali Khan1,
  • Leandro L Oliveira1
  • 1Universidade Federal de Viçosa
Leandro L Oliveira
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Protocol Citation: Daniel Silva Sena Bastos, Israr Ali Khan, Leandro L Oliveira 2025. Expressão e purificação de transcriptase reversa MMLV. protocols.io https://protocols.io/view/express-o-e-purifica-o-de-transcriptase-reversa-mm-g9jsbz4nf
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License,  which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: September 06, 2025
Last Modified: September 06, 2025
Protocol Integer ID: 226642
Keywords: M-MuLV RT, MMLV RT, Moloney Murine Leukemia Virus, rna para direcionar, transcriptase, rna, produzindo dna complementar, vírus da leucemia murina, por meio da transcrição reversa
Funders Acknowledgements:
FAPEMIG
Grant ID: BPD-00294-22
CNPq
Grant ID: 150438/2023-0
Abstract
A Transcriptase Reversa do Vírus da Leucemia Murina de Moloney (RT-MMLV) é uma DNA polimerase dependente de RNA. Essa enzima pode sintetizar uma fita complementar de DNA a partir de um molde de RNA, por meio da transcrição reversa, produzindo DNA complementar (cDNA). As transcriptases reversas (RTs) utilizam um molde de RNA e um primer curto complementar à extremidade 3' do RNA para direcionar a síntese da primeira fita de cDNA, que pode ser usada diretamente como molde para aplicações como PCR, qPCR, LAMP ou sequenciamento.
Materials
Tampão de Ligação
Concentration50 millimolar (mM) Tris-HCl, pH 8,0
Concentration150 millimolar (mM) NaCl
Concentration40 millimolar (mM) Imidazol

Tampão de Eluição
Concentration50 millimolar (mM) Tris-HCl, pH 8,0
Concentration150 millimolar (mM) NaCl
Concentration300 millimolar (mM) Imidazol


Troubleshooting
Transformação de células competentes
1d
Descongele uma alíquotaAmount50 µL de células competentes C41(DE3) TemperatureOn ice

Pipete Amount100 ng do plasmídeo contendo o gene RT-MMLV na alíquota e deixe o tubo descansar no gelo por Duration00:30:00

30m
Incube o tubo a Temperature42 °C por Duration00:00:45

45s
Rapidamente retorne o tubo para o gelo por Duration00:05:00

5m
Adicione ao tubo Amount500 µL de meio LB ou SOC e incube a Temperature37 °C por Duration01:00:00

1h
Centrifugue o tubo Centrifigation4500 rpm, Room temperature, 00:05:00

5m
Descarte o sobrenadante e plaqueie as células em uma placa de ágar LB previamente suplementada com AmpicilinaConcentration100 µg/mL

Incube a placa DurationOvernight a Temperature37 °C

Preparação do pré-inóculo
1d
Selecione uma colônia bacteriana isolada da placa e inocule em um tubo falcon com Amount5 mL de meio LB acrescido de ampicilina Concentration100 µg/mL . Incubar o tubo DurationOvernight sob agitação Shaker220 rpm, 37°C

Expressão da proteina
1d
Inocular 200 µL do pré-inóculo em um frasco Erlenmeyer com 200 mL de meio LB acrescido de ampicilina Concentration100 µg/mL . Incubar a Shaker220 rpm, 37°C até OD600 = 0,6-0,8 (4-5 horas).

adicionar IPTG a uma concentração final deConcentration0,4 millimolar (mM) e incubar aShaker220 rpm, 18°C, 16:00:00

Centrifugar a cultura de células Centrifigation5000 rpm, 4°C, 00:10:00 . Descartar o sobrenadante. Neste ponto, você pode armazenar o pelete de células a -20°C até que esteja pronto para executar a purificação.

5m
Purificação da proteína
2h 38m
Ressuspender o pelete de células em Amount20 mL de tampão de ligação e sonicar Duration00:08:00 (pulso 1 sec on 4 sec off) no gelo.

8m
centrifugar a Centrifigation8000 x g, 4°C, 00:10:00 . Colete o sobrenadante e identifique-o como fração solúvel. O pellet representa a fração insolúvel. Colete pequenas frações de cada uma para fazer um SDS-PAGE.

10m
Preparar a coluna HisTrap de 1 mL no sistema FPLC. Lavar o sistema e equilibrar a coluna com 7 volumes de coluna (c.v.) de tampão de ligação.
20m
Aplicar a amostra (fração solúvel) a um fluxo de 1 mL/min. Lave a coluna com 15 c.v. de tampão de ligação, até que o sinal de UV e condutividade se estabilize. Em seguida, elua a proteína ligada com 10 c.v. de tampão de eluição.

1h
Determinar as frações com o RT-MMLV, unir e dializar as frações eluídas. Adicionar glicerol a 50%, homogeneizar, fazer alíquotas de Amount400 µL , armazená-las a -20 °C.

1h