Sep 06, 2025

Public workspaceExpressão e purificação de Bst DNA polimerase

This protocol is a draft, published without a DOI.
  • Daniel Silva Sena Bastos1,
  • Israr Ali Khan1,
  • Leandro L Oliveira1
  • 1Universidade Federal de Viçosa
Leandro L Oliveira
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Protocol Citation: Daniel Silva Sena Bastos, Israr Ali Khan, Leandro L Oliveira 2025. Expressão e purificação de Bst DNA polimerase. protocols.io https://protocols.io/view/express-o-e-purifica-o-de-bst-dna-polimerase-g9jybz4px
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License,  which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: September 06, 2025
Last Modified: September 06, 2025
Protocol Integer ID: 226648
Keywords: Bacillus stearothermophilus, BST-LF, Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP, bst dna polimerase este, partir da expressão de seu gene, molecular esperado, amplificação isotérmica
Funders Acknowledgements:
FAPEMIG
Grant ID: BPD-00294-22
CNPq
Grant ID: 150438/2023-0
Abstract
Este protocolo descreve a produção e purificação da enzima BST DNA Polimerase (fragmento longo) a partir da expressão de seu gene recombinante na linhagem de Escherichia coli C41(DE3). O processo envolve a transformação das células, indução da expressão proteica e subsequente purificação da enzima por cromatografia de afinidade. Obtivemos a enzima com um alto rendimento de proteína solúvel e funcional, com a pureza e o peso molecular esperado confirmados por análise em SDS-PAGE. A atividade catalítica da enzima purificada foi validada por meio de um ensaio de amplificação isotérmica.
Materials
Tampão de Ligação
Concentration50 millimolar (mM) Tris-HCl, pH 8,0
Concentration150 millimolar (mM) NaCl
Concentration40 millimolar (mM) Imidazol

Tampão de Eluição
Concentration50 millimolar (mM) Tris-HCl, pH 8,0
Concentration150 millimolar (mM) NaCl
Concentration300 millimolar (mM) Imidazol

Tampão de Armazenamento
Concentration50 millimolar (mM) Tris-HCl, pH 7,6
Concentration150 millimolar (mM) NaCl
Concentration1 millimolar (mM) DTT
Concentration0,1 millimolar (mM) EDTA
Concentration0,1 % (v/v) IGEPAL CA-630
Concentration50 % (v/v) glicerol

Troubleshooting
Transformação de células competentes
1h 47m 45s
Descongele uma aliquota Amount50 µL de células competentes C41(DE3)TemperatureOn ice

Pipete Amount100 ng do plasmídeo contendo o gene BST-LF na aliquota, e deixe o tubo descansar no gelo por Duration00:30:00

30m
Incube o tubo a Temperature42 °C por Duration00:00:45

45s
Rapidamente retorne o tubo para o gelo porDuration00:05:00

5m
Repita os passos 3 e 4 mais 2 vezes para aumentar a eficiência de transformação
12m
Optional
Adicione ao tubo Amount500 µL de meio SOC ou LB, e incube aTemperature37 °C por Duration01:00:00

1h
centrifugue o tubo Centrifigation1000 x g, Room temperature, 00:05:00

Descarte o sobrenadante e plaqueie as células em uma placa de ágar LB previamente suplementada com canamicinaConcentration50 µg/mL

Incube a placaDurationOvernight aTemperature37 °C

Preparação do pré-inóculo
15m
Selecione uma colônia bacteriana isolada da placa e inocule em um tubo falcon comAmount5 mL de meio LB acrescido de canamicinaConcentration50 µg/mL . Incubar o tubo sob agitação Shaker220 rpm, 37°C Overnight

Expressão da proteina
21h 10m
Inocular 200 µL do pré-inóculo em um frasco Erlenmeyer com 200 mL de meio LB acrescido de canamicinaConcentration50 µg/mL . Incubar a Shaker220 rpm, 37°C até DO600= 0,6-0,8 (4-5 horas)

5h
Adicionar IPTG à uma concentração final de Concentration0,4 millimolar (mM) e incubar aShaker220 rpm, 18°C, 16:00:00

16h
Centrifugar a cultura de células Centrifigation1000 x g, 4°C, 00:10:00 . Descartar o sobrenadante. Neste ponto, você pode armazenar o pelete de células a -20°C até que esteja pronto para executar a purificação.

10m
Purificação da proteína
8m
Resuspender o pelete de células emAmount20 mL de tampão de ligação e sonicarDuration00:08:00 (pulso 1s on, 4s off) no gelo.

8m
Centrifugar Centrifigation8000 x g, 4°C, 00:10:00 . Colete o sobrenadante e identifique-o como fração solúvel. O pellet representa a fração insolúvel. Colete pequenas frações de cada uma para fazer um SDS-PAGE.

Preparar a coluna HisTrap de 1 mL no sistema FPLC. Lavar o sistema e equilibrar a coluna com 7 volumes de coluna (c.v.) de tampão de ligação.
Aplicar a amostra (fração solúvel) a um fluxo de 1 mL/min. Lave a coluna com 15 c.v. de tampão de ligação, até que o sinal de UV e condutividade se estabilize. Em seguida, elua a proteína ligada com 10 c.v. de tampão de eluição.
Determinar as frações com o BST-LF, unir e dializar as frações eluídas. Preparar alíquotas de 400 µL em tampão de armazenamento e armazená-las a -20 °C.