Sep 20, 2025
Expressão e Purificação da Taq Polimerase em E. coli C41(DE3)
This protocol is a draft, published without a DOI.
- Daniel Silva Sena Bastos1,
- Israr Ali Khan1,
- Leandro L Oliveira1
- 1Universidade Federal de Viçosa
Protocol Citation: Daniel Silva Sena Bastos, Israr Ali Khan, Leandro L Oliveira 2025. Expressão e Purificação da Taq Polimerase em E. coli C41(DE3). protocols.io https://dx.doi.org/
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: September 20, 2025
Last Modified: September 20, 2025
Protocol Integer ID: 227783
Keywords: biologia molecular, dna, este protocolo fornece, processo inclui crescimento celular
Funders Acknowledgements:
FAPEMIG
Grant ID: BPD-00294-22
CNPq
Grant ID: 150438/2023-0
Disclaimer
This protocol was imported from Methods Muse (beta).
Abstract
Este protocolo fornece um método detalhado para a expressão e purificação da Taq polimerase com uma tag hexahistidina em E. coli C41(DE3). O processo inclui crescimento celular, lise, clarificação e cromatografia de afinidade em duas etapas, seguido de diálise para armazenamento. Medidas de segurança adequadas e etapas de controle de qualidade são enfatizadas para garantir uma purificação bem-sucedida. A Taq polimerase é amplamente utilizada em reações de PCR devido à sua capacidade de sintetizar DNA a altas temperaturas, sendo essencial em diversas aplicações de biologia molecular.
Materials
Materials -
Células E. coli C41(DE3) 1 cultura
Meio LB 1 L
IPTG 0,4 mM
Sonificador 1 unidade
Coluna de afinidade Ni-NTA 1 coluna
Coluna de afinidade Heparina 1 coluna
NaCl 0 a 1 M
Tubo de diálise Conforme necessário
Tampão de armazenamento Conforme necessário
Reagents -
Isopropil β-D-tiogalactopiranosídeo
Imidazol
Cloreto de sódio
Safety warnings
Manuseie IPTG e imidazol com cuidado; use luvas e proteção ocular. Descarte os resíduos de acordo com as regulamentações locais.
Crescimento e Indução das Células
Inocule células de E. coli C41(DE3) transformadas com o plasmídeo contendo o gene da Taq polimerase em 200 mL de meio LB contendo 100 µg/mL de ampicilina e cresça a 37 °C com agitação a 200 rpm até que a OD600 atinja 0,6.
Induza a expressão da proteína adicionando IPTG a uma concentração final de 0,4 mM. Incube a 18 °C com agitação a 200 rpm por 16 horas.
Lise Celular
Coleta as células por centrifugação a 4.000 g por 20 minutos a 4 °C.
Ressuspenda o pellet em 20 mL de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA).
Sonifique a suspensão por 8 minutos (1 segundo ligado, 4 segundos desligado) em gelo.
Clarificação
Aqueça a amostra sonificada a 70 °C por 30 minutos para desnaturar proteínas.
Centrifugue a 12.000 g por 30 minutos a 4 °C para clarificar o lisado.
Cromatografia de Afinidade (Ni-NTA)
Carregue o lisado clarificado em uma coluna Ni-NTA pré-equilibrada usando o sistema AKTA Start.
Lave a coluna com 10 volumes de coluna de tampão de lavagem (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl).
Elua a Taq polimerase com tampão de eluição contendo 300 mM de imidazol.
Purificação Adicional (Heparina)
Dilua as frações eluídas em tampão Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) (1:10), e aplique em uma coluna de afinidade de heparina.
Lave a coluna com 10 volumes de coluna de tampão Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).
Realize uma eluição em gradiente de 0 a 1 M de NaCl ao longo de 20 volumes de coluna. Colete as frações
Diálise e Armazenamento
Dialise a enzima purificada contra o tampão de armazenamento (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl) durante a noite a 4 °C.
Armazene a Taq polimerase purificada a -20 °C com 50% de glicerol.
Protocol references
https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-59259-948-6_9
https://experiments.springernature.com/articles/10.1385/1-59259-679-7:179
https://experiments.springernature.com/articles/10.1385/1-59259-038-1:921
https://experiments.springernature.com/articles/10.1038/nprot.2006.388
https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-60761-913-0_17