Nov 18, 2020
Expressão de scPPx 1
This protocol is a draft, published without a DOI.
- 1Universidade Federal do Rio de Janeiro
- Phosphate
Protocol Citation: Mariana Jacques 2020. Expressão de scPPx 1 . protocols.io https://protocols.io/view/express-o-de-scppx-1-bpremm3e
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: In development
We are still developing and optimizing this protocol
Created: November 16, 2020
Last Modified: November 18, 2020
Protocol Integer ID: 44550
Materials
- Tampão C
60 mM Tris HCl pH=7,5, 6 mM MgCl2, Glicerol 30%
- Tampão B
60 mM Tris HCl pH = 7,5, 6mM MgCl2,
:
:
Tampão C
-60 mM Tris HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, Glicerol 30%.
Tampão B
- 60 mM Tris HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 250 mM Imidazol
Tampão de Lise
- ? mM Tris HCl pH 7,5, 200 mM NaCl, 5% Glicerol
Tampão A
- 60 mM Tris HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 10 mM Imidazol.
Cultura em 5mL
Cultura em 1 L
Crescer até 0,6 - 0,8 DO 600 ( Guardar 20 μL)
Induzir com 500 μM de IPTG por 3 h/ 37 °C
Centrifugar (____ min/_____ g) e ressuspender em 30 mL
Lisar ( Potência 30%/ 10 pulso de 10 seg a cada 1 min)
Spin 5000 g/ 10 min
Passar em filtro de 0.8 μm/ 0,4 μm
Centrifugar para baixar o debris celular, passar em filtro de 0,22 μm
Colunas
Colunas
Coluna de Níquel
20 ml Tampão A
5 mL Tampão A
8,5 ml Lisado
5 mL Tampão B
Coluna de Desalting
25 ml Tampão C
1,5 ml Amostra
2 ml Tampão C ( Recolher)
(Repetir esse processo 3 vezes)
25 ml Tampão C
1,5 ml Amostra