Oct 19, 2017

Public workspaceEnsayo angiogénesis in vitro

DOI
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.ju3cnyn
  • 1Centro de investigaciones biomédicas, Universidad del Quindío.;
  • 2Centro de Investigaciones Biomédicas - Universidad del Quindío
  • Grupo de inmunología molecular
Grupo De Inmunología Molecular GYMOL Universidad Del Quindio
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DOI: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.ju3cnyn
Protocol Citation: Germán Alberto Téllez Ramírez, Lily Johanna Toro, Jesica Palacio, Diana Carolina Henao, Jhon Carlos Castaño Osorio 2017. Ensayo angiogénesis in vitro. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.ju3cnyn
Manuscript citation:
1. Arnaoutova, I., and Kleinman, H. K. (2010) In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628–635
 
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License,  which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
Created: September 12, 2017
Last Modified: March 13, 2018
Protocol Integer ID: 7803
Keywords: Neovascularization, Angiogenesis, Angiogenesis Modulating Agents, In Vitro Techniques, Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Cell Culture Techniques
Abstract
Angionesis in vitro: Es la formación In vitro de tubos capilares por células endoteliales en la matriz de una membrana basal, es un metodo in vitro poderoso para evaluar varios factores que promueven o inhiben angiogenesis. Es para definir las rutas de señalización en angiogenesis, identificando los genes reguladores de angiogenesis y caracterizando las células endoteliales del progenitor.
El ensayo puede ser hecho como primera valoración antes de una prueba costosa con animales y puede ser hecho como un proceso de alta tecnología. Este es un método in vitro privilegiado para evaluar reguladores angiogenicos.
La realizacion de este protocolo fue posible gracias al apoyo del departamento administrativo de ciencia tecnología e innovacion, Colciencias a traves del proyecto 111356933173 convocatoria569-2012. 
Materials
MATERIALS
Reagent10µl Pipette TipsEppendorfCatalog #022491504
ReagentCultrex® 3-D Culture Matrix™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear®Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #3445-001-01
ReagentRecombinant Human VEGF-121 (carrier-free)BioLegendCatalog #583202
ReagentCalcein, AM, cell-permeant dyeThermo Fisher ScientificCatalog #C3100MP
ReagentDMEM, powder, high glucoseGibco - Thermo Fisher ScientificCatalog #12100046
ReagentEA.hy926 (ATCC® CRL-2922™)ATCCCatalog #CRL-2922
Reagentfetal bovine serumeurobioCatalog #CVFSVF0001
ReagentBasic Fibroblast Growth Factor, human (hbFGF)Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #11123149001
ReagentAntibiotic Antimycotic Solution (100×), StabilizedMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #A5955
ReagentSodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher ScientificCatalog #11360070
STEP MATERIALS
ReagentDMEM, powder, high glucoseGibco - Thermo Fisher ScientificCatalog #12100046
ReagentEA.hy926 (ATCC® CRL-2922™)ATCCCatalog #CRL-2922
Reagentfetal bovine serumeurobioCatalog #CVFSVF0001
ReagentSodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher ScientificCatalog #11360070
ReagentAntibiotic Antimycotic Solution (100×), StabilizedMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #A5955
ReagentPituitary Extract bovineMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #P1167-5MG
ReagentCultrex® 3-D Culture Matrix™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear®Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #3445-001-01
ReagentDMEM, powder, high glucoseGibco - Thermo Fisher ScientificCatalog #12100046
ReagentEA.hy926 (ATCC® CRL-2922™)ATCCCatalog #CRL-2922
Reagentfetal bovine serumeurobioCatalog #CVFSVF0001
ReagentSodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher ScientificCatalog #11360070
ReagentAntibiotic Antimycotic Solution (100×), StabilizedMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #A5955
ReagentPituitary Extract bovineMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #P1167-5MG
ReagentCultrex® 3-D Culture Matrix™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear®Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #3445-001-01
Protocol materials
ReagentSodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher ScientificCatalog #11360070
ReagentAntibiotic Antimycotic Solution (100×), StabilizedMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #A5955
ReagentPituitary Extract bovineMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #P1167-5MG
ReagentCultrex® 3-D Culture Matrix™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear®Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #3445-001-01
ReagentAntibiotic Antimycotic Solution (100×), StabilizedMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #A5955
ReagentSodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher ScientificCatalog #11360070
ReagentDMEM, powder, high glucoseGibco - Thermo Fisher ScientificCatalog #12100046
ReagentEA.hy926 (ATCC® CRL-2922™)ATCCCatalog #CRL-2922
Reagent10µl Pipette TipsEppendorfCatalog #022491504
ReagentCultrex® 3-D Culture Matrix™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear®Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #3445-001-01
ReagentEA.hy926 (ATCC® CRL-2922™)ATCCCatalog #CRL-2922
ReagentDMEM, powder, high glucoseGibco - Thermo Fisher ScientificCatalog #12100046
ReagentRecombinant Human VEGF-121 (carrier-free)BioLegendCatalog #583202
ReagentCalcein, AM, cell-permeant dyeThermo Fisher ScientificCatalog #C3100MP
Reagentfetal bovine serumeurobioCatalog #CVFSVF0001
Reagentfetal bovine serumeurobioCatalog #CVFSVF0001
ReagentSodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher ScientificCatalog #11360070
Reagentfetal bovine serumeurobioCatalog #CVFSVF0001
ReagentBasic Fibroblast Growth Factor, human (hbFGF)Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #11123149001
ReagentDMEM, powder, high glucoseGibco - Thermo Fisher ScientificCatalog #12100046
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ReagentCultrex® 3-D Culture Matrix™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear®Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #3445-001-01
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ReagentDMEM, powder, high glucoseGibco - Thermo Fisher ScientificCatalog #12100046
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Reagentfetal bovine serumeurobioCatalog #CVFSVF0001
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ReagentPituitary Extract bovineMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #P1167-5MG
ReagentCultrex® 3-D Culture Matrix™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear®Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #3445-001-01
Descongelar el extracto de membrana basal.
Descongelar el extracto de membrana basal.
Pasar el extracto de membrana basal del congelador de -80°C a 4°C un día antes de realizar del ensayo.
Note
El extracto de membrana basal se gelifica muy fácilmente, por lo tanto es importante no calentarlo como parte del proceso de descongelación y mantenerlo en hielo mientras se pipetea en las placas de cultivo celular. Este puede ser alicuotado y congelado a -20°C o -80°C o almacenado a 4°C por pocos días. Invertir el tubo con el extracto varias veces antes de alicuotar.
ReagentCultrex® 3-D Culture Matrix™ Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear®Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #3445-001-01
Pase de células EaHy926.
Pase de células EaHy926.
 La células se deben sembrar hasta una confluencia de 80% (Generalmente sembrar 5 x 105 (500.000) a 1 x 106 (1’000.000) células por cada recipiente de 25 cm2). Medio de cultivo (DMEM 1X, Antibiotico antimicotico 1X, piruvato de sodio 1mM, suero fetal bovino 10%, factores de crecimientos para celulas endoteliales 500ng/mL)
Note
Esta línea celular no debe exceder 12 pases. Las células deben ser pasadas al menos dos veces después de ser descongeladas de nitrógeno líquido.
ReagentDMEM, powder, high glucoseGibco - Thermo Fisher ScientificCatalog #12100046
ReagentEA.hy926 (ATCC® CRL-2922™)ATCCCatalog #CRL-2922
Reagentfetal bovine serumeurobioCatalog #CVFSVF0001
ReagentSodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher ScientificCatalog #11360070
ReagentAntibiotic Antimycotic Solution (100×), StabilizedMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #A5955
ReagentPituitary Extract bovineMerck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)Catalog #P1167-5MG
Cubrir placas de 96 pozos con el extracto de membrana basal.
Cubrir placas de 96 pozos con el extracto de membrana basal.
  • Sacar un tubo de extracto de membrana basal completamente descongelado (4ºC) llevar a hielo. Ubicar la placa de 96 pozos en hielo en cabina de flujo laminar. Invertir tubo con extracto de membrana basal para mezclar contenido. Adicionar 50-100 μl de extracto en cada pozo. Agitar suavemente para que el gel se extienda en toda la superficie.
  • Transferir la placa de 96 pozos a incubadora de cultivo celular y déjela a 37°C durante 30 minutos para dejar gelificar el extracto de membrana basal.
Note
Evitar burbujas de aire en el extracto de membrana basal al pipetear dentro de cada pozo. Si se forman burbujas centrifugar la placa a 300 g por 10 minutos a 4°C. Asegúrese que la centrifuga este previamente enfriada a 4°C antes de centrifugar la placa con el extracto.
Note
No agitar la placa durante el tiempo de gelificación debido a que se puede generar una superficie irregular en el gel.
Duration00:30:00 Gelificación extracto de membrana basal
Adhesión celular (Células endoteliales EaHy926)
Adhesión celular (Células endoteliales EaHy926)
  • Realizar la disgregación celular utilizando tripsina-EDTA (Gibco 25200056) hasta que la células queden desprendidas de manera individual con una viabilidad mayor del 90%.
  • brevemente:
  1. Lavar las celulas con PBS 1X  (NaCl 140mM; KCl 2,7mM; Na2HPO4 10,1mM; KH2PO4 1,8mM; pH 7,4).
  2. Adicionar 500μL de trypsina -EDTA. 
  3. Incubar a 37ºC por 5 minutos. 
  4. Colectar las celulas adicionando medio de cultivo (DMEM 1X suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%, antibiótico-antimicótico al 1X, piruvato de sodio a 1mM)
  5. Visualizar que las células esten disgregadas de forma individual y contar.
  • Asegurarse que las células estén bien mezcladas cuando se adicionen a cada pozo ya que la densidad celular tiene un efecto en la formación de tubo.
  • Sembrar las células sobre el extracto de membrana basal ya gelificado a una concentración de 15.000 células/pozo en 50 μL/pozo (confluencia del 85 a 90%) en placas de 96 pozos en medio de cultivo sin factores de crecimiento (DMEM 1X suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 0,5%, antibiótico-antimicótico al 1X, piruvato de sodio a 1mM).
Note
Trabajar con las células dos o tres pases depués de descongeladas.
Se adicionan el número de células por pozo necesarias para que alcancen una confluencia de 85-90%.
No tocar la superficie del gel cuando se adicionen las células y adicionar la suspensión celular lentamente para no dañar el material gelificado.
Preparación y adición de controles y tratamientos a evaluar
Preparación y adición de controles y tratamientos a evaluar
Preprarar los controles como sigue para 50μL/pozo:
  1. Blanco medio de cultivo: DMEM 1X suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 0,5%, antibiótico-antimicótico al 1X, piruvato de sodio a 1mM.
  2. Control positivo 2X factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF): DMEM 1X suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 0,5%, antibiótico-antimicótico al 1X, piruvato de sodio a 1mM, VEGF 80 ng/mL. 
  3. Tratamientos (#) 2X: DMEM 1X suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 0,5%, antibiótico-antimicótico al 1X, piruvato de sodio a 1mM)+tratamiento a realizar a 2X la concentracion a utilizar. 


Incubar la placa a 37°C, 5% CO2 en la incubadora de cultivo celular por un periodo de 24 horas o hasta que los resultados deseados sean adquiridos. 
Duration24:00:00 Incubar la placa con los tratamientos a evaluar
Calceina AM
Calceina AM
Posterior a las 24 horas de incubación, adicionar 50 μL/pozo de Calceina AM (Ref. C3100MP, Invitrogen) a una concentración final en el pozo de 6 μM e incubar nuevamente por 30 minutos.
Duration00:30:00 Incubar la placa con Calceina AM
Conteo de tubos vasculares
Conteo de tubos vasculares
  • Fotografíar y contar la formación de tubos vasculares para cada uno de los pozos siguiendo un esquema consecutivo de campos a 40X hasta explorar el total del área de cada pozo usando un microscopio de fluorescencia invertido con filtro: excitación 485 nm y emisión 520 nm (EVOS H0910-9031-000).
  • El conteo de tubos capilares formados se deberá realizar por 2 observadores independientemente.
  • Realizar el promedio de dichas observaciones y anotar en una hoja de cálculo para posterior análisis estadístico. 
Note
Tubo vascular : Cierre completo de células endoteliales en una sola luz.
Análisis estadístico
Análisis estadístico
Evaluar normalidad de los datos para cada grupo de tratamientos por medio de una prueba de Shapiro-Wilk con un alfa de 0,05; una vez definida la normalidad en los datos, realizar un análisis de varianza de una vías (ANOVA) con software PRISM (GraphPad, San Diego, CA) para observar si existe diferencias estadísticamente significativas entre los grupos, tambien se puede hacer una comparación de medias mediante la prueba T Student comparando los tratamientos versus el control de medio de cultivo. Las diferencias se consideran estadísticamente significativas para un valor de P < 0,05.