Jan 28, 2025
Version 3
Dosagem de proteínas por BCA V.3
- 1University of Sao Paulo
Protocol Citation: Isis Paiva Trajano 2025. Dosagem de proteínas por BCA. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.ewov1dxw2vr2/v3Version created by Isis Paiva Trajano
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: January 27, 2025
Last Modified: January 28, 2025
Protocol Integer ID: 119210
Abstract
O ensaio de ácido bicinconínico (BCA) é um método bioquímico que determina as concentrações de proteína entre 20 e 2000 μg/mL numa solução. A dosagem de proteínas por BCA é feita através da mudança de cor da solução, que passa de azul para roxo. O valor de absorbância da amostra é comparado a uma curva padrão para determinar a concentração de proteína.
Pierce BCA Protein Assay
The bicinchoninic acid (BCA) assay is a biochemical method that determines protein concentrations ranging from 20 to 2,000 μg/mL in a solution. Protein quantification by BCA is performed through a color change in the solution, which shifts from blue to purple. The absorbance value of the sample is compared to a standard curve to determine the protein concentration.
Materials
- Kit Pierce BCA Protein Assay da ThermoFisher
- Luvas
- Microtubo Eppendorf 0,5 mL (1 por amostra)
- 6 tubos Eppendorf 1 mL
- 1 placa de ELISA de 96 poços
- Becker com H2O mQ
- Isopor com gelo
- Agitador vórtex
- Solução padrão
- Solução A
- Solução B
- Pipeta 0.5 - 10 µL
- Pipeta 10 - 100 µL
- Pipeta 0,1 - 1 mL
- Pipeta 1 - 5 mL
- Pipeta multicanal
- Ponteira 20 µL
- Ponteira 200 µL
- Ponteira 1 mL
- Ponteira 5 mL
Before start
Preparar bancada com papel pardo e separar materiais.
Planejamento do ensaio
Planejamento do ensaio
Planejar e desenhar o layout das placas.
Exemplo de layout.
Preparo das amostras
Preparo das amostras
Deixar as amostras descongelando no isopor com gelo.
Separar e identificar 1 eppendorf 0,5 mL para cada amostra.
Adicionar água miliQ aos tubos, de acordo com a concentração. O volume total deve ser de 50 µL.
Ex. Para uma amostra diluída a 1:50, adicionar 49 µL de H2O mQ + 1 µL de amostra cocncentrada.
Assim que as amostras descongelarem descongelarem, agitar o tubo no vórtex e pipetar a quantidade de amostra no Eppendorf 0,5 mL com H2O mQ correspondente (de acordo com a sua concentração). Finalizar com agitação do tubo com a amostra diluída.
Deixar os tubos de amostras diluídas no gelo durante a preparação da curva.
Preparo da curva
Preparo da curva
Identificar os tubos Eppendorf de 1 mL de acordo com cada ponto da curva, exceto 2000.
Adicionar 40 µL de H2O mQ nos tubos de 1 mL.
Fazer diluição seriada da solução padrão de acordo com a imagem. O ponto mais alto da curva é a própria solução padrão concentrada.
Agitar o tubo antes de pipetar e trocar de ponteira a cada diluição.
Preparo da placa
Preparo da placa
Pipetar 10 µL de cada ponto da curva e das amostras em duplicata nos poços de acordo com layout pré-desenhado. No BLK pipetar 10 µL de H2O mQ.
Preparar solução de trabalho.
Diluição 1:50 (1 Reagente B/ 49 Reagente A)
Ex. Para uma placa de 96 poços completa, será necessário 19,2 mL de solução de trabalho.
Preparar um pouco a mais de solução, por exemplo 20 mL, o que corresponde a 400 µL de Reagente B + 19,6 mL de Reagente A.
Agitar solução de trabalho antes de adicionar à placa.
Pipetar 200 µL da solução de trabalho em cada poço.
Leitura da placa
Leitura da placa
Incubar a placa a 37 ºC durante 30 minutos.
Obs. A leitora pode ser ligada e aquecida um pouco antes para que ao colocar a placa na leitora ela ja esteja na temperatura certa.
Deixar a placa em temperatura ambiente por 5 minutos.
Ler a placa a 562 nm.