Aug 22, 2024
Bakteriel WGS - SSI
- 1Department of Sequencing and Bioinformatics;
- 2Statens Serum Institut
- SSI - SB - Sequencing Core FacilityTech. support email: [email protected]
Protocol Citation: Theis Hass Thorsen, Sekventeringsenheden SB 2024. Bakteriel WGS - SSI. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.5qpvo3r7bv4o/v1
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We used this protocol before automating the workflow.
Created: August 08, 2023
Last Modified: August 22, 2024
Protocol Integer ID: 86116
Keywords: Sequencing, Bacterial sequencing, Bacterial WGS, WGS, NGS, Genome, Bacterial genome, SSI, Statens Serum Institut, MiSeq, Illumina, Bacteria, bacterial isolate, isolates with large genome, sequencing core facility, nextseq for the sequencing, throughput sequencing, sequencing platform, sequencing, genome, ssi method, large genome, isolate
Funders Acknowledgements:
European Health and Digital Executive Agency (HaDEA)
Grant ID: 101111879
Disclaimer
This method is a scaled version of the original 'Illumina Nextera XT DNA Library Prep'.
See under References for a link to the original protocol.
Abstract
Method used at Sequencing Core Facility - Statens Serum Institut for sequencing of bacterial isolates.
This protocol is specified for high-throughput sequencing of 96 isolates (sometimes less depending on the number of isolates with large genomes). Furthermore, the genomes are sequenced on the Illumina sequencing platform using a MiSeq and the MiSeq 500-cycle v2 kit.
Note, this protocol is in Danish.
Note, it is also possible to use a 300-cycle Mid Output Kit v2.5 on a NextSeq for the sequencing, but this will not be covered in this protocol.
Image Attribution
Guidelines
For at begrænse krydskontaminering, skift spidser stort set efter hver brug.
Materials
Instrumenter:
- Køl/Frys
- Stinkskab
- Vortex
- Centrifuge (1,5 mL rør, PCR rør/plader)
- Qubit 4 Fluorometer (Invitrogen - Thermo Fisher Scientific (TFS))
- PCR-maskine
- Tapestation 4200 (Agilent Technologies)
- Miseq (Illumina)
Redskaber:
- Beskyttelsesbriller
- Pipetter - p10, p100, p200, p1000, p5000, p10000
- Multikanalpipette - 0,2-10 µL
- Magnetholder (96-brønds plader)
Forbrugsvarer:
- 1,5 mL "Lo-bind" rør
- 50 mL rør
- 96-brønds "Lo-bind" PCR-plader
- 8-rør "thin-walled" PCR-strimmel
- Qubit rør (#Q32856, Invitrogen - TFS)
- Pipettespidser (p10, p100, p200, p1000, p5000, p10000)
- "Seals"
- Propper til index rør (FC-131-2001 - FC-131-2004, Illumina)
- Fnugfri linse renseservietter
- Handsker (gerne med høj gennembrudstid)
- Is
Protocol materials
Amplicon Tagment MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
Tagment DNA BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
Neutralize Tagment BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
Nextera PCR Master MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
Resuspension BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
AMPure XP beadsBeckman CoulterCatalog #A63881
EtOH
Nuclease-free Water
1 M NaOH
HT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
PhiX Control v3Illumina, Inc.Catalog #FC-110-3001
10 mM Tris-Cl pH 8.5 with 0.1% Tween-20TeknovaCatalog #T7724
MiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
PR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
D5000 ScreenTapeAgilent TechnologiesCatalog #5067-5588
D5000 ReagentsAgilent TechnologiesCatalog #5067-5589
MiSeq 500 cycle Kit v2 - Flow CellIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
MilliQ water
1 M NaOH
Index adaptersIllumina, Inc.Catalog #FC-131-2001 - FC-131-2004
Qubit™ 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen - Thermo FisherCatalog #Q33231
Safety warnings
Arbejd forsigtigt og med den/de korrekte beskyttelsesværn (laboratoriekittel, handsker og beskyttelsesbriller, stinkskab) når der arbejdes med følgende reagenser:
Tagment DNA Buffer
Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
N,N-Dimethylformamid
Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
Before start
Fortynding af DNA-oprensninger
Inputkoncentrationen for de forskellige DNA-oprensninger kan være organismespecifik. Det vil sige at der kan være forskel på, hvor meget DNA der skal bruges til analysen ved sekventering af f.eks. en Salmonella vs Clostridium.
En ting der skal overvejes, inden der startes en WGS-kørsel, er hvor mange isolater det er muligt at samle i én kørsel, og dermed hvor mange Mbp der bruges til den endelige sekventering. I denne protokol benyttes en "500 cycles" kassette (MiSeq), der max. kan "loades" med 90 Mbp.
Til denne protokol fortyndes inputkoncentrationerne for DNA-oprensningerne normalt til 0,3 til 0,5 ng/µL. DNA-oprensningerne kan med fordel fortyndes i en 96-brønds PCR-plade, hvor koncentrationerne kan bestemmes med en Fluostar Omega Platereader.
Tagmentering af input-DNA
1m
Find følgende komponenter frem.
Komponenter opbevaret på frost:
Amplicon Tagment MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
Tagment DNA BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
- Tø op på is. Vend de optøede rør 3-5 gange og centrifugér derefter kortvarigt.
Safety information
Tagment DNA Buffer
Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og handsker med høj gennembrudstid).
Komponent opbevaret ved stuetemperatur:
Neutralize Tagment BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
- Tjek for bundfald. Hvis der er bundfald til stede, vortex indtil alle partikler er resuspenderet.
Safety information
Følgende arbejde bør foregå i et stinkskab, da Tagment DNA Buffer indeholder N,N-Dimethylformamid.
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og handsker med høj gennembrudstid).
Navngiv en standard 96-brønds PCR-plade med "NTA" + et unik ID.
Tilføj 5 µL Tagment DNA BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 til brøndene ved hjælp af en multikanalpipette.
Overfør prøverne - 2.5 µL DNA pr. prøve fra fortyndingspladen (justeret til 0.3-0.5 ng/µL ).
Tilføj 2.5 µL Amplicon Tagment MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 til hver brønd.
Brug en multikanalpipette indstillet på 10 µl til at blande hver prøve forsigtigt 5 gange.
"Seal" pladen og centrifugér den ved 280 x g, 20°C, 00:01:00 .
1m
Placér pladen i en PCR-maskine og kør følgende opvarmningsprogram:
"Tagmentation" program
| Temp. | Tid | Runder | |
| 55°C | 05:00 | 1 | |
| 10°C | ∞ | 1 |
"Tagmentation" program
Så snart temperaturen når 10 °C , centrifugér pladen kortvarigt og fjern forseglingen, tilsæt herefter 2.5 µL Neutralize Tagment BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 til hver brønd.
Brug en multikanalpipette indstillet på 10 µl til at blande hver prøve mindst 5 gange.
"Seal" pladen og centrifugér den ved 280 x g, 20°C, 00:01:00 .
1m
Inkubér pladen i 00:05:00 stuetemperatur .
Fortsæt herefter med næste trin.
5m
PCR amplificering af biblioteker
4s
Find følgende komponenter frem.
Komponenter opbevaret på frost:
Index adaptersIllumina, Inc.Catalog #FC-131-2001 - FC-131-2004
- Optø ved stuetemperatur. (Rør) Vortex for at blande og centrifugér derefter ved 12000 rpm, 00:00:15 . [Plader] Spin 00:00:30 før brug.
Nextera PCR Master MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
- Optø på is i 20 minutter.
45s
Tilsæt 7.5 µL Nextera PCR Master MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 til hver brønd i NTA-pladen.
"Seal" og centrifugér pladen i ~00:00:04 .
4s
Tilsæt 2.5 µL fra den første Nxxx-indeks primer (orange propper) til hver brønd i den første kolonne på NTA-pladen. Gør derefter det samme med den anden indeks primer i den anden kolonne, og fortsæt til alle brønde har fået indeks (se Figur 1).
Smid den gamle prop ud og sæt en ny på (dette gøres for at forhindre kontaminering af primerrøret).
Figur 1: Oversigt over hvor de forskellige indeks adapterer skal tilsættes i NTA-pladen. Nxxx-indeks adapterer (orange propper) tilsættes kolonnevis, og Sxxx-indeks adapterer (hvide propper) tilsættes rækkevis.
Tilsæt 2.5 µL fra den første Sxxx-indeks primer (hvide propper) til hver brønd i den første række på NTA-pladen. Gør derefter det samme med den anden indeks primer i den anden række, og fortsæt til alle brønde har fået indeks (se Figur 1).
Smid den gamle prop ud og sæt en ny på (dette gøres for at forhindre kontaminering af primerrøret).
Bland indholdet i brøndene 3-5 gange med en multikanalpipette indstillet til 10 µL.
"Seal" pladen. Spin ned ved 280 x g, 00:01:00 .
1m
Kør NTA-pladen på følgende PCR-program:
| Temp. | Tid | Runder | |
| 72°C | 03:00 | 1 | |
| 95°C | 00:30 | 1 | |
| 95°C | 00:10 | 12 | |
| 55°C | 00:30 | ||
| 72°C | 00:30 | ||
| 72°C | 05:00 | 1 | |
| 10°C | ∞ | 1 |
PCR-program
Sikkert stoppested
Hvis det ikke er planlagt at fortsætte direkte efter denne PCR, skal pladen enten blive i termocykleren ved 10 grader natten over eller opbevares i køleskabet i op til to dage.
Rengøring af PCR-produkter
1m
Find følgende komponenter frem.
Komponenter opbevaret på frost/køl:
Resuspension BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
- Tø op og bring til stuetemperatur. Vortex for at blande. "Resuspension Buffer" kan opbevares ved 2°C til 8°C efter den indledende optøning.
Komponenter opbevaret på køl:
AMPure XP beadsBeckman CoulterCatalog #A63881
- Lad stå ved stuetemperatur i 30 minutter. Vortex og vend for at blande.
Lav op til 50 mL 80 % (v/v) EtOH fra absolut ethanol - nok til 96 prøver.
Centrifugér NTA-pladen ved 280 x g, 00:01:00 for at samle indholdet i bunden af brøndende.
1m
Vortex AMPure XP beadsBeckman CoulterCatalog #A63881 .
"Beads" skal have stuetemperatur, før der fortsættes.
Tilsæt 11.25 µL AMPure XP beadsBeckman CoulterCatalog #A63881 til hver brønd i NTA-pladen.
Bland forsigtigt hver brønd 10 gange (brug en multikanalpipette sat til 50 µL).
Inkubér NTA-pladen i 00:05:00 stuetemperatur .
5m
Placér pladen på en magnetisk holder i ~00:02:00 - eller indtil supernatanten er helt klar.
2m
Lad NTA-pladen blive på den magnetiske holder.
Indstil en 200 µL multikanalpipette til 40 µL, fjern forsigtigt supernatanten og kassér den.
VIGTIGT: Undgå at forstyrre pellet. Hvis pellet forstyrres skal supernatanten pipetteres tilbage i brøndene og stå i yderligere 2 minutter.
Vask prøverne to gange på følgende måde:
Imens NTA-pladen bliver på den magnetiske holder tilsættes 200 µL friskblandet 80 % (v/v) EtOH - bland ikke prøverne.
Inkubér prøverne i 00:00:30 .
30s
Fjern og kassér supernatanten uden at forstyrre pellet.
(Efter 1. vask )
Brug en 10 µL multikanalpipette til at fjerne de sidste rester af EtOH fra brøndene - vær stadig forsigtig med ikke at forstyrre pelleten.
Lad NTA-pladen stå på den magnetiske holder i 00:15:00 for at lufttørre pelleten.
15m
Fjern NTA-pladen fra den magnetiske holder og tilsæt 22 µL Resuspension BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 til hver brønd.
Bland forsigtigt 10 gange med en multikanalpipette.
Inkubér pladen i 00:05:00 stuetemperatur .
Anbring derefter pladen på den magnetiske holder i 00:05:00 indtil supernatanten er helt klar.
10m
Navngiv en ny plade "CAN" (Clean Amplified Plate) + et unik ID.
Overfør 20 µL supernatant fra NTA-pladen til den nye CAN-plade.
Note
Hvis der er spor af "AMPure beads" i suspensionen (ses typisk som en svag farvning af supernatanten), pipetteres denne tilbage og inkuberes i yderligere 00:02:00 på magnet holderen. NTA-pladen kan kasseres efter en vellykket overførsel af supernatanten.
Sikkert stoppested
Hvis det ikke er planlagt at fortsætte direkte, kan CAN-pladen opbevares ved -15 til -25˚C i op til 1 uge, ellers fortsæt til trin 37.
Bestem DNA-koncentrationen i CAN-pladen med et
Equipment
Qubit 4
NAME
Fluorometer
TYPE
Invitrogen
BRAND
Q33238
SKU
LINK
med et Qubit™ 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen - Thermo FisherCatalog #Q33231 (mål på 2 µL).
Note
Hvordan man måler på Qubit (2 µL prøve)
- Tag et antal Qubit-rør (Invitrogen - Thermo Fisher #Q32856) frem matchende antallet af prøver + 2 mere til standarder.
- Pipettér følgende volumener af "working solution" til de to typer af rør: 198 µL til alle prøverør samt 190 µL til de to rør til standarder.
- Tilføj 10 µL af hhv. standard #1 og #2 til hvert sit rør til standarderne med "working solution" (den totale volumen skal være 200µL).
- Tilføj 2 µL fra hver prøve til hvert sit prøverør med "working solution" (den totale volumen skal være 200µL).
- Vortex alle rør og inkubér dem i 00:02:00 ved stuetemperatur. Tjek at der ikke er nogle bobler i væsken.
- Fra forsiden på instrumentet vælg dsDNA og derefter 1x dsDNA High Sensitivity.
- Vælg Read Standards og følg anvisningerne.
- Efter begge standarder er målt, vælg Run samples og sørg for at "original sample volume" er sat til 2µL, samt at "output sample units" er sat til ng/µL.
- Sæt den første prøve i instrumentet og vælg Read tube. Notér koncentrationen.
- Forsæt med de resterende prøver.
Normalisering og "final pool"
Under normaliseringen beregnes der, hvor meget der skal overføres fra hver enkelte prøve til en "final pool", således at hver prøve sekventeres med tilstrækkelig dybde.
Det gøres ved hjælp af et excel-ark hvor beregningerne er "automatiseret" og tager forhold til bakteriernes gns. genom størrelse og prøve koncentrationerne samt den ønskede slutkoncentration og slutvolumen på "final pool".
Download og benyt følgende excel-ark:
Normalisering og final pool - SSI.xlsx32.5KB Under Trin 1 indtastes:
- Batch navn
- Navn på eksperiment
- Dato for det udførte arbejde
- Laboranten der udfører arbejdet
Under Trin 2 indtastes for hver prøve, ud for den rette brøndposition:
- Prøve ID
- Organismens latinske navn
Den tilhørende genom størrelse tilføjes automatisk baseret på organismens navn.
Under Trin 3 indtastes:
- Den ønskede slutkoncentration (i nM) for "final pool"
(i denne protokol er den sat til 4 nanomolar (nM) ).
- Den ønskede "pooling" volumen (i uL) for "final pool"
(i denne protokol er den sat til 300 µL ).
Under Trin 4 indtastes:
- De målte koncentrationer for prøverne i ng/uL (blå kolonne)
Værdierne i de efterfølgende kolonner udregnes automatisk.
Hvis en prøve har en koncentration < 1 ng/uL, er koncentrationen for lav.
I det/de tilfælde skal den tilhørende værdi i kolonne x grr (rød kolonne) ændres til '0'. Hvilket fjerner prøven fra de videre beregninger, og der bliver ikke overført noget fra prøven til den endelige "final pool".
Overfør for hver prøve den tilhørende beregnede volumen angivet i kolonnen uL fra prøve til "final pool" (grøn kolonne) til et nyt 1,5 mL rør.
Dette er "final pool".
Note
Der er kun 18 uL tilbage af hver prøve i CAN-pladen (efter Qubit-målingen).
Hvis der skal bruges mere end 18 uL - prøv at sænke den ønskede slutvolumen for "final pool".
Note
Hvis der er spor af "AMPure beads" i "final pool", kan røret sættes på en magnetholder i ~00:05:00 , eller indtil væsken er klar, hvorefter hele volumen (uden "beads") kan overføres til et nyt 1,5 mL rør.
For at være sikker på at "final pool" har den ønskede molær slutkoncentration, lav endnu en koncentrationsbestemmelse på følgende måde:
Bestem DNA-koncentrationen i "final pool" med et Qubit fluorometer (se trin 37).
Bestem den gns. fragmentstørrelse i "final pool" - f.eks. på en
Equipment
4200 TapeStation System
NAME
Automated electrophoresis platform
TYPE
Agilent
BRAND
G2991BA
SKU
LINK
med følgende komponenter:
D5000 ScreenTapeAgilent TechnologiesCatalog #5067-5588 D5000 ReagentsAgilent TechnologiesCatalog #5067-5589
Note
Se under References for en "quick guide" til Tapestation D5000 screen tapes.
Fordelen ved at bestemme den gns. fragmentstørrelse er:
- Det er muligt visuelt at se, om der er noget galt med biblioteket, inden der fortsættes til sekventeringen.
Åben excel-arket: Normalisering og final pool - SSI.
Under Trin 5 indtastes:
- DNA-koncentrationen i "final pool" (i ng/µL)
- Den gns. fragmentstørrelse i "final pool" (i bp)
Den reelle molær slutkoncentration udregnes automatisk, samt om det er nødvendigt at fortynde "final pool" yderligere.
Hvis det er nødvendigt, fortynd "final pool" med Resuspension BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 som nævnt under Trin 5.
Sekventering
Find følgende reagenser frem.
Opbevares ved stuetemperatur:
10 mM Tris-Cl pH 8.5 with 0.1% Tween-20TeknovaCatalog #T7724
Opbevares på køl:
1 M NaOH
PR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
MiSeq 500 cycle Kit v2 - Flow CellIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
Opbevares på frost:
PhiX Control v3Illumina, Inc.Catalog #FC-110-3001
HT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
- Stil på is når det er tøet op.
MiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
- Kan sættes på køl dagen før for at tø.
Note
Det er også muligt at sekventere biblioteket på en NextSeq 500/550 med et NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2.5 (300 Cycles). Men dette vil ikke blive dækket i denne protokol.
Denaturering og fortynding af bibliotek
Lav en frisk 0.2 Mass Percent fortynding af NaOH.
I et eppendorfrør blandes 400 µL Nuclease-free Water med 100 µL 1 M NaOH .
Vortex kort.
Overfør 5 µL fra "final pool" til et nyt 1,5 mL rør.
Tilsæt 5 µL 0.2 M NaOH.
Vortex og centrifugér ved 280 x g, 00:01:00 .
1m
Inkubér i 00:05:00 stuetemperatur .
5m
Tilsæt 990 µL afkølet HT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 til røret (koncentrationen er nu 20 picomolar (pM) ).
Vortex og centrifugér kortvarigt.
Sæt røret på is.
Fortynd til 10 picomolar (pM) i et nyt 1,5 mL rør ved at blande 300 µL 20 picomolar (pM) denatureret bibliotek med 300 µL afkølet HT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 .
Vend røret et par gange og centrifugér kortvarigt.
Sæt røret på is.
Hvis det ønskes at tilsætte en PhiX kontrol til det denatureret bibliotek inden sekventeringen - fortsæt til trin 52.
Hvis det ikke ønskes at tilsætte en PhiX kontrol - gå til trin 61.
I et 1,5 mL rør, miks 2 µL 10 nanomolar (nM) PhiX Control v3Illumina, Inc.Catalog #FC-110-3001 med 3 µL 10 mM Tris-Cl pH 8.5 with 0.1% Tween-20TeknovaCatalog #T7724
Tilsæt 5 µL 0.2 Mass Percent NaOH til røret.
Vortex og centrifugér ved 280 x g, 00:01:00 .
1m
Inkubér i 00:05:00 stuetemperatur .
5m
Tilsæt 990 µL afkølet HT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 til røret (koncentrationen er nu 20 picomolar (pM) ).
Note
Den 20 picomolar (pM) denatureret PhiX kontrol kan opbevares på -20 °C op til 3 uger.
Overfør 375 µL 20 picomolar (pM) PhiX kontrol til et nyt 1,5 mL rør.
Tilsæt 225 µL afkølet HT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 til røret (koncentrationen er nu 12.5 picomolar (pM) ).
Fjern 6 µL fra det 10 picomolar (pM) denatureret bibliotek (prøverne).
Tilsæt 6 µL 12.5 picomolar (pM) PhiX kontrol til det denatureret bibliotek (prøverne).
Vend røret et par gange og centrifugér kortvarigt.
Sæt røret på is.
MiSeq kørsel
Safety information
MiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 indeholder N,N-Dimethylformamid (position 8 i kasetten).
Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og handsker med høj gennembrudstid).
Vend MiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 ti gange og PR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 fem gange for at blande reagenserne.
Sikre at alle reagenser er tøet op, er blandet og at der ikke er luftbobler i bunden af de forskellige reservoir.
På MiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 , prik hul i folieforseglingen ved det markerede reservoir "Load Samples" med en ren 1 mL pipettespids.
Overfør hele 10 picomolar (pM) prøve biblioteket til reservoiret.
Undgå at røre ved folieforseglingen.
Tryk på Sequence på skærmen af
Equipment
MiSeq
NAME
Sequencer
TYPE
illumina
BRAND
SY-410-1003
SKU
LINK
Vælg én af tre "setup" muligheder:
Local Run Manager
Note
På forhånd klargøres kørslen ("Create run") i Local Run Manger (LRM) med de ønskede indstillinger og prøveinformationer.
I denne protokol vælges der paired end,
og
Index 1 og Index 2 sættes til 8,
Read 1 og Read 2 sættes til 251.
LRM åbnes enten fra skrivebordet på instrumentet, ved at åbne chromium eller ved at åbne og logge ind på LRM fra en arbejdscomputer, hvis computer og instrument er på samme netværk.
Se Local Run Manager Off-Instrument Software Guide (1000000011909) for hjælp til den sidste mulighed.
Vælg det ønskede "run" fra listen med klargjorte kørsler.
Tryk på Next.
Sample Sheet
Note
På forhånd udfyldes et "sample sheet" med alle de ønskede indstillinger og prøveinformationer.
I denne protokol køres der med paired end,
og
Read 1 og Read 2 sættes til 251.
Index 1 og Index 2 indstilles automatisk til 8, når "sample sheet" uploades på instrumentet.
Eksempel på "sample sheet": 
Eksempel på MiSeq Sample sheet.xlsx12.7KB .
Eksempel på MiSeq Sample sheet.xlsx12.7KB . Noter:
- Grønne områder omkranset af '<...>' skal udfyldes/ændres med de ønskede informationer.
- "Sample Sheet" skal gemmes som .csv-fil. Ellers accepterer instrumentet ikke filen.
"Browse" og vælg det klargjorte "sample sheet".
Tryk på Next.
Manual
Vælg paired end .
Indtast følgende informationer:
Index 1 og Index 2 sættes til 8,
Read 1 og Read 2 sættes til 251.
Vælg den ønskede "output folder".
"Browse" og vælg det klargjorte "sample sheet" (skal indeholde prøve ID og index' på alle prøverne).
Se trin 65.2 for en skabelon til et "sample sheet".
Tryk på Next.
Inden MiSeq 500 cycle Kit v2 - Flow CellIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 sættes i instrumentet.
Skyl flow cellen grundigt men forsigtigt med MilliQ water for at skylle buffer og eventuelle saltrester af flow cellen.
Tør forsigtigt men grundigt flow cellen med fnugfri linse renseservietter.
Vær meget forsigtig omkring de sorte flow celle porte samt glasset på flow cellen.
Skyl glasset på flow cellen med 70 % (v/v) EtOH (undgå at ramme de sorte porte), og tør det forsigtigt af igen med fnugfri linse renseservietter (der kan gemme sig meget i revnerne på flow cellen).
Vær sikker på at glasset er fri for striber, fingeraftryk, fnug og fibre.
Hold på kanterne af flow cellen uden at røre ved glasset.
Placér flow cellen i instrumentet som ansvist på skærmen.
Tryk på Next.
Åben lågen under skærmen.
Løft håndtaget til de to "sipper", som anvist på skærmen, indtil det låser på plads.
(Håndtaget er placeret imellem de to flasker)
Fjern den gamle flaske med buffer (står i midten) og tøm affaldsbeholderen (står til højre).
Fjern låget fra PR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 .
Indsæt PR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 og den tomme affaldsbeholder på deres rette position som anvist på skærmen.
Sænk langsomt håndtaget til de to "sipper".
Sørg for at de to "sipper" sænkes ned i PR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 og affaldsbeholderen.
Tryk på Next.
Åben lågen til kølerummet (til venstre).
Fjern den gamle vaskekassette.
Hold MiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 i håndtaget i bagenden af kassetten ved Illumina mærket og skub den ind i kølerummet indtil den stopper.
Luk lågen til kølerummet.
Tryk på Next.
Tjek at "run parameters" passer og tryk på Next.
Når instrumentet er færdig med sit "pre-run check", tryk på Start Run.
Hvis "Start run after pre-run check" er valgt til under kørselsindstillingerne, begynder kørslen automatisk, når instrumentet er færdig med sit "pre-run check".
Hvor lang tid tager kørslen?
En kørsel med en MiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 tager ~39 timer.
Protocol references
Illumina Nextera XT DNA Library Prep:
Illumina MiSeq System Denature and Dilute Libraries Guide - # 15039740 v10:
Illumina MiSeq System Guide - # 15027617 v06:
D5000 ScreenTape Assay for TapeStation Systems - Quick Guide: